制药行业活性物质提取中应用最为广泛的层析技术是离子层析，离子层析是目标物质和带相反电荷的介质以静电力的作用结合，然后在用高离子或改变pH的方式进行洗脱。特别要注意，蛋白的pI表征的是蛋白表面的净电荷，然而离子交换层析时是蛋白的局部电荷和介质作用，另外离子交换介质吸附的一类物质，如阳离子交换介质吸附带正电荷的物质，所以在纯化过程中，需要配合层析过程进来合理的结合及洗脱过程，才能达到预期的结果。本文总结了一些离子层析的技术要点和常见的问题及解答，希望能对各位同行有所帮助。

柱层析分离净化的实验技巧和方法

1、柱层析操作方法的选择

目前 ,柱色谱分离的操作方式 ,主要包括常压分离、减压分离和加压分离 3种模式。常压分离是最简单的分离模式方便、简单 ,但是洗脱时间长。减压分离尽管能节省填料的使用量 ,但是由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发 ,并且有时在柱子外面会有水汽凝结 ,以及有些易分解的化合物也难以得到 ,而且还必须同时使用水泵或真空泵抽气。加压分离可以加快淋洗剂的流动速度 ,缩短样品的洗脱时间 ,是一种比较好的方法 ,与常压柱类似 ,只不过外加压力使淋洗液更快洗脱。压力的提供可以是压缩空气 ,双连球或者小气泵等。

2、柱子规格的选择

市场上有各种规格的柱层析分离柱。柱子长了 ,相应的塔板数就高 ,分离就好。目前市场上的柱子 ,其径高比一般在1: 5～10范围 ,在实际使用时 ,填料量一般是样品量的 30～40倍 ,具体的选择要根据样品的性质和含量进行具体分析。如果所需组分和杂质的分离度较大 ,就可以减少填料量 ,使用内径相对较小的柱子 (如 2 cm × 20 cm的柱子 ) ;如果 Rf相差不到 0.1,就要加大柱子 ,增加填料量 ,比如用 3 cm内径的柱子。

3、装柱

柱层析色谱柱的填装主要有湿法和干法两种 ,湿法省事 ,一般用淋洗剂溶解样品 ,也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等 ,但溶剂越少越好 ,不然溶剂就成了淋洗剂了。柱子底端的活塞一定不要涂润滑剂 ,否则会被淋洗剂带到淋洗液中 ,可以采用聚四氟乙烯材料的阀门。干法和湿法装柱没什么实质性差别,只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该有适度的紧密(太密了淋洗剂流速太慢 ) ,并且一定要均匀 ,不然样品就会从一侧斜着流动。同时柱中不能有大气泡 ,大多数情况下有些小气泡没太大的影响 ,因为只要加压气泡就可消失。但是柱子更忌讳的是开裂 ,开裂会影响分离效果 ,甚至报废。

4、溶剂的选择

选择一个合适的溶剂系统是柱层析分离的关键。在选用柱层析洗脱剂时首先要考虑三个方面的因素:溶解性 ( Solubil2ity)、亲合性 (Affinity)和分离度 (Res oluti on)。溶剂应选择价廉、安全、环保的 ,可以考虑石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲醇和正己烷等等。但正己烷价格较高 ,乙醚很易挥发 ,二氯甲烷和甲醇与硅胶的吸附是一个放热过程 ,易使柱子产生气泡。其他的溶剂用的相对较少 ,要依不同需要选择。另外值得一提的是 ,由于我们进行的是痕量分析 ,淋洗剂的纯度必须关注 ,一般使用农药残留级或 HPLC级的 ,如果是分析纯的必须进行精制。同时溶剂在过柱后最好回收使用 ,一方面环保 ,另一方面也能节省部分经费。

5、上样

用少量的溶剂溶解样品加样 ,加完后将底端的活塞打开 ,待溶剂层下降至石英砂面时 ,再加少量的低极性溶剂 ,然后再打开活塞 ,如此两三次 ,一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂 ,一开始不要加压 ,等溶解样品的溶剂和样品层有一段距离 (2～4 cm) ,再加压 ,这样避免了溶剂 (如二氯甲烷等 )夹带样品快速下行。很多样品在上柱前粘性较大 ,上样后在柱上又会析出 ,这一般都是比较大量的样品才会出现 ,是因为填料对样品的吸附饱和所致。有些样品溶解性差,能溶解的溶剂 (比如 DMF,DMSO等)又不能上柱 ,这样就必须用干法上柱了。

6、淋洗液的收集和浓缩

用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。如果样品与硅胶的吸附比较强的话 ,就不容易流出 ,这时可以采用氧化铝作固定相。柱层析后的淋洗液 ,由于使用了较多的溶剂 ,必须进行浓缩 ,如果待测物具有一定的挥发性 ,最好使用常压挥发溶剂 ,否则易导致检测结果偏低。

7、疑问及解答

问：我是用DEAE-Sepharose FF自己填充的玻璃柱，请问DEAE-Sepharose FF使用一次之后可以直接用第二次吗？中间要怎么再生处理呢？

答：可以用的，先用0.5mol/l氢氧化钠溶液冲三遍柱子，将填料弄出，用蒸馏水洗至中性。

问：色素沉积在层析柱中，对层析过程有影响吗？层析柱每次用完都需要CIP清洗吗？

答：色素沉积在层析柱中，不仅对其分辨率，收率有影响，更严重影响其使用寿命。

层析填料使用过程中是否需要每次使用后都要对其进行CIP清洗，取决于样品的属性，如若用在精纯阶段，并非每次都需要CIP清洗，如若用在捕获阶段，样品杂质很多且杂质成分复杂，每次层析后层析柱污染都比较严重则需要每次都CIP。

问：层析柱反压升高怎么办？

答：首先将层析柱和层析系统断开，检查层析系统（检测系统及系统管路）的背景压力是否升高，在确保层析系统无异常的情况下在对层析柱进行CIP。若CIP进行过程反压太高，难以进行，此时就要拆柱，拆柱后查看曾希祖上筛网的状态，进行超声清洗或者更换上筛网。若出现板结现象，拆柱倒出填料，进行清洗，比在位CIP有更好的清洗效果。

更多请参考下表：

问：怎么选择离子交换层析的层析柱？

答：用Tris-HCl还是PB，选择的依据是蛋白质的稳定性和活力在哪个缓冲液中好，浓度一般10-50mM，但是缓冲液应与样品缓冲液有相同的pH和离子强度。

问：目标蛋白洗脱不下来或洗脱下来的蛋白量较小怎么办？

答：a. 洗脱强度不够：增加洗脱的离子强度

1. 目标蛋白在洗脱过程中发生聚集沉淀：优化洗脱条件
2. 发生非特异性结合：优化层析条件
3. 填料载量太低：更换合适的层析填料

问：洗脱峰出现拖尾现象是什么原因？

答：a. 洗脱强度不够：增大洗脱强度

1. 柱子装的均匀：重新装柱
2. 柱床上端液面太高：柱床上端液面控制在0.5cm以内。

问：提纯的目标产物纯度较低，是什么原因导致的？

答：a. 样品复杂或者前处理不到位：层析前离心或过滤处理样品，或者优化层析体系，选择合适的离子交换填料和层析体系（缓冲液）

1. 样品粘度态高：用缓冲液适当的稀释样品，或者选择高分辨率填料（如SP-HPR等进行优化，降低上样量等尝试优化。
2. 清洗不彻底：增加清洗的柱体积数
3. 洗杂不彻底：优化洗杂的条件，增加洗杂的柱体积数
4. 目标物出现降解：优化层析条件，选择合适的层析条件或者添加蛋白稳定剂等
5. 柱料装填效果不佳：装填的不均匀，柱效低，重新装柱
6. 分离柱顶部有较大的储样体积：装柱避免分布器离柱料上层液面太高，应保持在0.5cm高度以内。
7. 洗脱条件不佳：优化洗脱条件，比如缓慢的拉盐梯度洗脱
8. 填料分辨率下降：对填料进行清洗或者更换填料。

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