大规模细胞培养已成为生物药生产过程中最大的变异因素，批间差异往往较大，难以控制。在遇到此类问题时我们通常会从人员、设备、物料、法则、环境等角度思考和解决，但并不总能发现及解决此问题。另外随着项目推进进入临床后期，需要对工艺进行scale-down，然后进行工艺表征研究。工艺的scale-up或scale-down时经常会遇到不同规模的反应器的工艺属性及质量属性有较大差异，给工艺的转移和表征带来较大的困扰。因此更深层次的了解生物反应器内的微环境，以及微环境与细胞之间的相关作用，可以为解决此类问题提供强有力的手段。

1 Scale-up and Scale-down

在进行Scale-up时通常习惯将工艺参数分为非体积相关的参数和体积相关的参数。

表1.1 工艺参数分类

非体积相关的参数	体积相关的参数
pH, DO, 温度，补料策略等	转速，通气等

我们的策略通常是保持非体积相关的参数一致，体积相关的参数根据经验或一些model进行放大或缩小，而并没有对细胞培养的微环境进行深度分析，这可能会导致大规模反应器与小试反应器不一致的表现以及大规模细胞培养的较大的批间差。

非体积相关的参数并不是总是被保持一致，比如DO，有时考虑到大规模反应器液压及溶氧梯度的存在，不同规模反应器的DO设置会存在一些微小差异。

对于体积相关的参数的放大或缩小，目前行业实践提供了较多的经验公式，比如等K_La、等p/V、等叶尖速率、等表观通气速率等。但由于使用的生物反应器结构的差异、不同项目的差异（细胞和工艺的差异）及尚未完全理解的细胞与环境的相互作用，使得细胞培养放大或缩小没有普遍适用的原则。

表1.2 常用的Scale-up 或Scale-down 经验公式

在确定大规模生物反应器工艺时还应考虑以下因素：

溶氧传质、搅拌及流体剪切、通气及气体损伤、混合时间、DO梯度、CO₂去除等。

不管使用何种原则，都不可能保持不同规模规模反应器中上述因素一致。因此在工艺放大或缩小时需要对工艺有较深的理解：工艺对那些因素比较敏感，耐受的范围大概是多少等等。

2 流体混合

流体混合的均一性可以用层流和湍流模型进行解释，一般认为当雷诺数Re＜2300时，流体为层流，2300＜Re＜8000~10000时为不充分湍流，Re＞8000~10000时为充分的湍流。CHO细胞培养搅拌式生物反应器内产生的流动一般都是属于湍流。雷诺数可定义为：

Re=ρND²/μ

（式中，ρ为流体密度，N为搅拌桨的搅拌转速，D为搅拌桨直径，μ为流体粘度）

混合时间是表征反应器内流体混合特性的常用参数，定义为反应器内流体混合均匀性达到95%所需的时间，可通过添加示踪剂的方式进行测定，比如酸碱，混合时间的检测相对来说比较容易。

图2.1 混合时间的测定

（图片来源：Scale-Up Analysis for a CHO Cell Culture Process in Large-Scale Bioreactors）

混合时间tmix=(t1+t2)/2

另外对于搅拌式生物反应器，目前文献报道了较多的混合时间计算经验公式，如果不想通过研究测定t_mix，也可以通过经验公式进行估算。

tmix=KV^aRe^b/D或tmix=V /(nND³)

（式中，K，a, b为常数，与反应器自身结构等有关，V为培养体积，D为搅拌桨直径，N为搅拌转速）

表2.1 参数与混合时间的关系

主要参数	与混合时间的关系
培养体积	正相关
搅拌桨转速	负相关
搅拌桨直径	负相关
搅拌桨数量	负相关
通气	几乎没有影响

较大的混合时间会导致大规模反应器内DO或pH产生梯度，如果工艺对DO或pH等参数较为敏感，这可能会导致生产的失败。这个时候需要尽量减小混合时间，或改变DO或pH设定值及控制范围。另外目前很多细胞培养工艺补加的华体会体育最新地址 是酸性或碱性，较大的混合时间也会导致在补料时局部pH较低或较高，对细胞产生较大的杀伤作用，引起生产的失败，这个时候除可以降低混合时间外，还可以对补料口进行设计，将补料口靠近搅拌桨区域，以达到快速混合的目的。

但大规模反应器内混合时间并非越小越好，因为较低的混合时间往往伴随着较高的搅拌桨剪切和流体剪切。

对于流体剪切力，有文献报道剪切力大于1N/m²会对细胞造成损伤（实际中，我们发现CHO细胞可耐受的流体剪切力要大于1N/m²）。

根据Kolmogorov湍流理论，流体剪切力（）可用下述公式进行计算：

对此公式进行推导简化可得

（式中μ是液体粘度，P/V为单位体积功率输入）

当V取V_i(V_i=D³)时，此时计算的剪切力为局部剪切力，我们需要控制局部剪切力尽量不要超过1N/m²太多。

湍流流体的混合会产生涡流，当涡流尺度较大时可以将细胞包裹在涡流中，对细胞的伤害较低，当涡流的尺度接近或低于细胞直径时，无法包裹细胞，会将能量耗散到细胞上，从而对细胞产生较大的损伤，因此理论上，F68对于涡流产生的细胞损伤没有效果。

图2.2 涡流剪切

（图片来源：Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: what we learned, how it affected the cell culture industry and what we would like to know more about）

根据Kolmogorov湍流理论，处于湍流能谱粘性耗散区的搅拌式生物反应器内涡流尺度（η）可由以下公式计算：

（式中：v是流体的运动粘度=μ/ρ）

当计算η时的培养体积V取Vi=D³时，此时计算的局部涡流尺度，我们需要控制局部涡流尺度值尽量的远离细胞的直径。

图2.3 转速、规模与涡流尺度的关系

（图片来源：动物细胞培养用生物反应器内流体混合及气液传质特性研究）

3 搅拌及剪切

反应器内的能力输入主要是由搅拌桨搅拌带入。目前使用最频繁的scale-up or scale-down 公式便是单位体积的能力输入：

（式中Np为搅拌桨的功率准数，n为搅拌桨个数，N为搅拌转速，D为搅拌桨的直径，V为培养体积）

由于该公式简单实用，被广泛使用，但该公式的使用效果并不能总是令人满意。

搅拌为混合和传质的最主要动力，过低的P/V值会导致混合的不充分，而较高的P/V值促进了流体的混合和溶氧传质，但同时会带来涡流、剪切的问题，从而加速细胞的死亡。

搅拌剪切力对细胞造成的损伤包括物理损伤和生理损伤。物理损伤为细胞凋亡和破碎，生理损伤包括细胞生长、代谢和蛋白表达的变化。搅拌造成的剪切力强度主要由3个因素决定：华体会体育最新地址 粘度、搅拌桨的构造和转速。目前最常用叶尖线速度U_T来反应搅拌剪切力大小。

Chalmers等曾报道动物细胞可耐受的最大叶尖线速度为2m/s。但此值不应该独立看待，不同通气速度时，细胞可耐受的搅拌剪切力会有很大的不同，通气速度越大，细胞可耐受的搅拌剪切力会越小。

4 溶氧传质

溶氧传质是大规模细胞培养最关心的因素，随着华体会体育最新地址 、宿主细胞、工艺的越来越强大，对溶氧传质的要求也越来越高。目前Fed-batch培养时K_La实际需求往往都能达到5-6 h^-1，甚至更高。

表4.1 影响表观传质系数K_La的参数

主要参数	与KLa的关系	原理
通气/气泡直径	越小直径提高KLa	越小的通气/气泡直径提高气液比表面积（a）
搅拌桨转速/直径	正相关	降低气泡直径，同时降低气液传质膜厚度，降低传质阻力
深层通气量	正相关	提高气液比表面积（a）
液体粘度	负相关	增加气液传质膜厚度，提高传质阻力
温度	正相关	高温降低液体粘度
液面高度	正相关	液压作用及增加气体滞留时间
表层通气	微弱正相关	NA

可以通过上述公式计算出氧气的表观传质系数K_La, 目前最常使用的方法有亚硫酸钠氧化法、动态法、直接法等。考虑到细胞培养过程中K_La在不停的变化，因此检测及计算出最极端情况下K_La才最有意义（即通气、搅拌需求最大的一段时刻）。在这里推荐静态法检测和计算此时的K_La。

• 确认细胞培养处于通气及搅拌需求最大时刻。
• 确认DO处于稳定控制状态，然后关闭所有通气。
• 记录时间和DO，当DO达到5%左右时即可。
• 根据亨利定律将记录DO值转化为溶液中氧气浓度值Ct。
• 根据不同时间的Ct值，求解出细胞的耗氧速率：dC/dt。
• 根据dC/dt= K_La（C*-C）求解出K_La

完成K_La测定后，开启DO及通气控制。

再通过改变P/V或u_g值得到至少3个方程，便可以计算出下述公式中常数项的值，从而求解出下述方程，建立等K_La经验公式。

（式中，A,a,β为常数项，u_g为表观通气速度）

如何使用等K_La经验公式？建立K_La公式后，可以根据设定一系列P/V值，然后根据公式求解出对应的u_g值，再根据P/V及u_g值计算出一系列其他影响因素，比如混合时间，涡流尺度，流体剪切，搅拌剪切，通气剪切，pCO₂等参数，根据这些参数确定最佳的P/V及u_g组合。

5 通气及损伤

通气是大规模细胞培养非常关注的另一个参数，对细胞培养的微环境影响巨大：影响溶氧传质、pCO2、泡沫等，同时也可能会给细胞带来巨大的损伤。所以通气必须被严格的控制在合适的范围。如前所述，气泡的直径大小对K_La具有非常显著的影响，影响气泡直径的因素主要有：

图5.1 通气速率、Sparger大小与气泡直径的关系

（图片来源：动物细胞培养用生物反应器内流体混合及气液传质特性研究）

（Sparger孔径单位为um）

• sparger 开孔孔径与气泡直径正相关，但不会随着开孔孔径无限增大（Bellman and Pennington曾提出最大稳态气泡直径大约为4mm）；
• 通气速率的提高，导致气泡聚集，使气泡的直径变大；
• 在细胞培养反应器中，液压对气泡的直径影响非常小；
• 搅拌转速的提高会加速气泡的破裂，减小气泡直径，对越大的气泡效果越明显；

另外液体粘度，表面张力等因素也对气泡大小有影响。

气泡在液体中由于受到浮力等力的作用，导致在上升过程中并不是直线上升，其在液体中上升的速度主要在0.21~0.25m/s之间。气泡在上升过程不断的从气相传递到液相（比如氧气溶解）或从液相传递到气相（比如二氧化碳的去除）。单位时间内气相的减少量等于从气相传递到液相的量，得到微分方程：

（式中，V_b和A_b分别表示气泡的体积和表面积，V₁为液相体积，V_m为该条件下气体的摩尔体积，K_L为传质系数）

根据亨利定律可得：

C^*=k_HC_b

(式中k_H表示溶解度系数，C_b表示气相中该气体的摩尔分数)

带入上式后积分可得：

（式中d₁,d₂分别表示进气和出气时气泡直径，表示气泡滞留时间）

当反应器足够高时，气泡将完全溶解，此时d₂=0，此时得到：

由于CO₂的溶解度系数远大于O₂，导致同等条件下，CO₂更快的溶解，溶解速度是氧气的25倍左右。在最佳条件下，直径2mm的O₂完全溶解的时间在100s作用，相对应反应器高度为25m左右，而直径2mm的CO2溶解时间大约为4.2s左右，对应反应器的高度仅为1m左右。

气泡从sparger到出气口会带来三个高剪切力区域：sparger出口，气泡上升区域和气泡破裂区域。

Zhu等在研究600L和10000L反应器放大过程中，发现如果sparger出口气体流速高于30m/s，即使提高F68浓度，细胞也会受到很大的损伤，开始凋亡。当将10000L反应器的sparger出口气体流速限制在24m/s以下时，成功的实现了工艺的放大。

谭文松等曾研究通气速率及气泡大小对细胞杀伤，发现越高的通气速率，越小的气泡直径其杀伤作用越强，并且搅拌剪切力的杀伤作用严重依赖通气。Kunas等也发现，在2L生物反应器中，不通气的情况下，杂交瘤细胞可以抵抗700r/min的高转速。

气泡破裂时造成的剪切力是反应器中所有操作中最强的。Boulton-Stone等报道，气泡破裂会带来10⁷w/m³级别的高剪切力，对细胞有强烈的破坏作用，且气泡直径越接近于细胞直径，其破坏产生的杀伤力越大。Trinh等实验显示，当没有F68或其他保护剂存在时，每个直径3.5mm的气泡可以杀死约1050个细胞，添加适量F68后，细胞死亡被完全抑制。F68能够大大降低气泡破裂带来的杀伤作用，主要是由于F68能降低气泡表面张力，降低细胞的吸附。

图5.2 F68对气泡杀伤作用的影响

（图片来源：Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: what we learned, how it affected the cell culture industry and what we would like to know more about）

6 二氧化碳去除

细胞培养过程中的二氧化碳主要来源于细胞代谢产生，过高或过低的pCO₂影响生长和表达。pCO₂与溶液中HCO₃^-成正相关，与pH负相关：

pCO₂=B/ s/ 10^(pH-pK)

（式中，B为HCO₃^-浓度，S为CO₂分压与液相中浓度的换算系数，pK为解离常数）

大量文献报道过降低pCO₂手段，比如用其他缓冲体系代替碳酸氢盐，增加深层和表层通气量等等。这里主要从气液传质角度理解pCO₂去除或积累的原因，为解决大规模生物反应器中pCO₂积累提供理论参考。

如图6.1所示，对于初始100mmgH的pCO2的去除，当页面高度达到0.8m时，就能达到气液平衡，而大规模生物反应器的装液高度均大于0.8m。这表明正常情况下大规模生物反应器中二氧化碳的气液传质均能达到平衡，那么此时二氧化碳的去除效率只和通气量大小有关，与气泡直径，搅拌等均无关。

图6.1 二氧化碳去除气液平衡与高度关系

（图片来源：动物细胞培养用生物反应器内流体混合及气液传质特性研究）

因此计算大规模生物反应器的二氧化碳去除速率可用公式：

（式中，F_g为通气速率，V_m为气体的摩尔体积，V₁为培养体积，C_b,in为进气中二氧化碳浓度，一般为0，C_b,off为尾气中二氧化碳摩尔分数）

C_b,off可根据亨利定律来计算。

细胞培养过程中主要通过深层通气的方式来供应氧，同时达到去除二氧化碳的目的。氧的消耗速率（OUR）和二氧化碳的生成速率（CER）一致，即CER=OUR=OTR（氧传质系数），当OTR= CER＞CTR时即会造成二氧化碳的积累。当OTR=CER≤CTR时便不会造成二氧化碳的积累，此时反应器会通过补充二氧化碳来维持pCO2与pH之间的平衡关系。这也是为什么微泡容易导致二氧化碳积累的原因，因为微泡的OTR非常高，而大规模生物反应器中CTR并不受气泡孔径的影响，因此微泡通气很容易导致OTR= CER＞CTR，致使pCO2升高。

那么为什么大规模生物反应器二氧化碳容易积累（无论是大泡还是微泡）？这个需要结合上述K_La和CTR公式考虑，随着培养体积的扩大，在保持等K_La时，通气量F_g/V₁(即vvm）是在降低的，而大规模生物反应器中二氧化碳的去除主要与vvm正相关，因此大规模反应器中二氧化碳容易被积累。

基于以上结果，我们可以计算出为控制pCO₂在某水平时需要鼓入的总的通气速率，将总的通气速率减去氧气的通气速率即可以得到需要额外通入的空气的速率。

另外基于以上结果可得，微泡或大泡通入相同量的气体去除二氧化碳的效果一致，因此为降低通气损伤，在大规模反应器中通过大泡来鼓入空气去除二氧化碳。（备注：在二氧化碳去除未达到气液平衡时，在相同通气量下微泡的二氧化碳去除效果更好）

总结

大规模生物反应器工艺参数的确定基于小试反应器工艺，加上对流体混合、传质、搅拌、通气、剪切、pCO2去除等因素的综合考虑而确定。深度理解细胞培养的微环境对解决大规模生物反应器中遇到的问题提供强有力的支持。

参考文献：

1：动物细胞培养用生物反应器内流体混合及气液传质特性研究

2：Scale-Up Analysis for a CHO Cell Culture Process in Large-Scale Bioreactors

3: Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: what we learned, how it affected the cell culture industry and what we would like to know more about

4: Effect of antifoam addition on gas-liquid mass transfer in stirred fermenters

5: computer simulations of the rupture of a gas bubble at a gas-liquid interface and its implications in animal cell damage

6: Gas bubbles bursting at a free surface

7: A semi-empirical mathematical model useful for describing the relationship between carbon dioxide, pH, lactate and base in a bicarbonate-buffered cell-culture process

8: Effects of Elevated pCO2 and Osmolality on growth of CHO cells and Production of Antibody-Fusion Protein B1: A case study

9: 生物反应器中杂交瘤细胞的物理破损

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