1.Protein L填料纯化抗体原理

原理：Protein L是大消化链球菌细胞壁上的一种胞壁蛋白，它可以与Ig的轻链进行特异性地结合，不与Ig的Fc片段结合。Protein L主要结合位点为Ig轻链的可变区，并且对kappa轻链的亲和力要比对λ轻链的强, 与 Ig 结合后不影响Ig的抗原结合位点 。Protein L与Protein A或Protein G相比，能更广泛地结合各种来源及亚类的抗体，如可结合IgG、IgM、IgA、IgE和IgD以及单链可变片段(scFv)和Fab片段。将Protein L偶联至填料上，既可从发酵液、动物腹水或血清中纯化Ig

※虽然Protein A和Protein G也可以与部分IgG的Fab片段进行结合，但是它与Protein L结合的位点不同，并且Protein L能够结合抗体的Fab类型更加广泛

2.Protein L填料介绍

Protein L填料主要是通过偶联试剂将填料基质进行活化，再将Protein L蛋白与活化基团进行反应并以共价键的形式与填料连成一个统一的整体。

偶联至填料上的Protein L蛋白相对稳定，在使用4mol/L尿素、硫氰酸胍、6mol/L的盐酸胍处理后，仍可保持活性。

天然的Protein L蛋白可以耐受很低浓度的NaOH，因而可以使用NaOH溶液对其进行再生处理，但NaOH溶液浓度不能超过15mM，对内毒素的控制不如Protein A填料方便，正是因为该原因，限制了Protein L填料的应用。

对于Protein L填料采用的基质主要有琼脂糖基质，葡聚糖修饰的琼脂糖基质，纤维素基质，以及聚合物基质(如PS基质，硅胶基质)。基质的材质可以影响配基的偶联量，继而影响填料的载量；基质粒径及孔径的大小可以影响纯化过程使用的流速以及抗体与填料的结合速率

3.Protein L与Protein A、Protein G结合抗体区域对比

4. Protein L填料纯化抗体的流程

所需试剂：

平衡：1X PBS ，pH7.4

洗杂Buffer： 1X PBS +适合浓度的盐，pH7.4

洗脱Buffer：0.1M甘氨酸或0.05M/0.1M柠檬酸或0.1M醋

酸 (pH范围为2.0~3.5)

中和Buffer：1M Tris-HCl， pH8.5

实验步骤：

1.将Protein L填料装入层析柱中，使用≥ 5倍填料体积的平衡Buffer对填料进行平衡

2.将样品进行上样过柱(样品上样前需经过0.45um/0.22um的滤膜过滤处理)，上样流速参照选用Protein L填料说明书

3.使用5~10倍填料体积的洗杂Buffer清洗填料

4.使用3~5倍填料体积的洗脱Buffer对进行洗脱，收集洗脱液时可以分管进行收集

5.向收集的洗脱液中加入1/10倍体积的中和Buffer

6.填料再生：使用3倍填料体积的平衡Buffer清洗填料；使用5倍填料体积的15mM NaOH溶液清洗填料以取出填料上的残留杂质，NaOH与填料的接触时间~15min；使用5倍填料体积平衡Buffer清洗填料再次平衡填料。若保存填料，可以用20%乙醇溶液置换出其中的平衡Buffer，放于2~8℃保存即可

※当填料性能出现明显下降时，可以在再生步骤最开始时先使用8 M 尿素, 50 mM柠檬酸, pH 2.5清洗填料30min，再按照再生的后续步骤处理即可

一般情况下，使用Protein L填料一步纯化也可获得95%以上的抗体纯度，这与Protein A和Protein G填料类似

5.Protein L对各类型抗体亲和力比较

FAQ：

1.纯化出的抗体量少

①检查样品流经填料后的穿透液→如穿透液中有大量未结合的抗体，可以换用其他配基的填料如Protein A或Protein G填料；可以降低上样流速

②抗体在洗脱的过程中发生了沉淀→优化洗脱液，如适当提高洗脱液的pH；在低温下洗脱

③抗体与填料结合牢固，未能被洗脱→使用更低pH的洗脱液洗脱；增加洗脱液的盐浓度

2.纯化的抗体中含有大量杂蛋白

①使用的填料过多→根据填料的载量减少填料的使用量

②洗杂不充分→增加洗杂液的体积；适当提高洗杂液中的盐浓度；适当调低洗杂液的pH进行洗杂

③非特异性吸附→在洗杂液中加入终浓度为0.1%的Tween-20

④抗体发生降解→处理样品时加入蛋白酶抑制剂

⑤未知原因→洗脱时采用分管收集

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