样品准备的意义

在使用填料从样品中进行纯化蛋白时，应保证样品澄清，无颗粒物。使用澄清的样品可以避免堵塞色谱柱，有效减少洗杂的步骤，延长层析填料的使用寿命。

在准备样品时，样品的来源，目标蛋白的稳定性，使用层析填料的类型决定了样品的处理方式及缓冲液、添加剂和洗涤剂的选择。

样品稳定性

一般情况下，蛋白的检测需要使用有活性的蛋白，纯化后的目标蛋白应保留其活性，因此在准备样品和纯化过程中均需保持其目标蛋白的活性。样品中的组分如果发生变性，可能会导致沉淀的产生或者增加非特异性吸附，如果用层析填料纯化这种样品，易发生堵柱的现象。所以，在纯化过程中检查样品的稳定性极限并在这些极限内处理或操作样品对保护填料非常重要。

蛋白通常具有三级结构，并且通常由范德华力，离子和疏水作用力，氢键共同维持蛋白的三级结构。可以对这些力造成破坏的因素可能导致蛋白的变性致使蛋白沉淀。多肽一般三级结构程度较低，性状主要由其二级结构决定，主要是通过氢键对其结构进行稳定。蛋白和多肽的这种性质不同决定了蛋白不易复性，而多肽通常较容易复性

在使用填料对样品进行纯化前，可以对样品进行一些稳定性的测试，主要方法如下：

①在pH 2.0和pH 9.0之间，以1个pH单位为梯度测试pH稳定性

②用0至2 M NaCl和0至2 M (NH4)SO4之间，以0.5M的盐浓度为梯度测试盐稳定性

③在0%和50%之间，以10%的梯度测试对乙腈和甲醇的稳定性

④从4 ℃到40 ℃之间，以10 ℃的梯度测试稳定稳定性

⑤使用小份样品测试蛋白质是否易水解。将样品在室温下过夜，离心，测量蛋白的活性并测上清液在280nm处的吸光度变化情况

样品的澄清

离心和过滤是在实验室对样品澄清的标准技术，在处理小量样品时经常使用。样品在离心或过滤后最好立即使用层析填料进行纯化。

离心主要可以去除脂质和颗粒物质，如细胞碎片。如果离心后样品仍然不清澈，可以先使用滤纸或5微米滤膜作为第一步过滤，再使用更小孔径的滤膜作为第二步过滤，使用的滤膜孔径如下表。

样品的前处理

在样品的处理时，有时会用到高盐对目标蛋白进行沉淀的方式进行粗提，再使用缓冲液对沉淀蛋白进行复溶，由于复溶后蛋白溶液中可能含有的盐浓度相对较高，不能直接使用离子交换填料进行纯化，需要对蛋白溶液的Buffer置换，降低蛋白溶液的盐离子浓度，对此可以采用透析置换Buffer，也可以使用脱盐柱置换Buffer

在样品处理时不仅可以选择沉淀目标蛋白，也可以选择沉淀杂质，使目标蛋白保留在溶液中

经常使用的沉淀试剂如下表：

硫酸铵沉淀法处理样品

有些蛋白质会被硫酸铵破坏，在添加结晶硫酸铵时注意；高浓度的硫酸铵可能会导致多余的杂蛋白共沉淀；在目标蛋白浓度<1mg/ml时，一般不采用硫酸铵沉淀的方式

硫酸铵沉淀所需溶液：

饱和硫酸铵溶液（向100ml纯化水中加入100g硫酸铵，搅拌溶解）

1 M Tris-HCl, pH 8.0

用于第一步纯化的Buffer

硫酸铵沉淀步骤：

1.将样品进行离心或过滤，取上清

2.向上清液中加入1/10倍体积的1 M Tris-HCl, pH 8.0，以维持溶液PH

3.边滴加饱和硫酸铵溶液边轻轻搅拌已使蛋白沉淀(滴加量因蛋白性质会有所变化)

4.离心，收集沉淀

5.使用和沉淀时相同浓度的硫酸铵溶液清洗沉淀2次

6.使用后续第一步纯化的Buffer溶解沉淀

7.使用脱盐柱对蛋白溶液脱盐以除去蛋白溶液中含有的硫酸铵

沉淀蛋白的复溶

很多经过盐析沉淀的蛋白可以使用缓冲液进行复溶，可直接用于后续的层析填料纯化。然而有些蛋白使用普通的缓冲液不易复溶或者不能复溶，这就需要借助一些化学试剂促进蛋白的溶解，通常使用的化学试剂为尿素和盐酸胍。尿素的使用浓度一般为2~8M，盐酸胍的使用浓度一般为3~6M

样品缓冲液置换及脱盐

对样品进行缓冲液的置换最常用的方法为透析，在准备对样品透析时，可以根据蛋白的分子量选择不同孔径的透析袋，一般选用透析袋的孔径为目标蛋白分子量的1/3为佳，如目标蛋白的分子量为30kDa，则最好选用10kDa的透析带对其进行透析。使用透析的方式置换缓冲液具有简单方便，需要的设备简单，一次可以处理多个样品的优点。其缺点是：透析所需时间较长，随着样品体积的增多，所需要的缓冲液会成倍增加，该方式不适用于大体积样品的缓冲液置换。

随着层析填料技术的发展，使用脱盐柱(如G-25填料)的方式对样品进行缓冲液置换具有快速，方便的优点，并且处理的样品可以通过增加填料体积的方式进行放大，基于这些优点，使用脱盐柱的方式对样品缓冲液的置换越来越盛行。使用脱盐柱进行缓冲液置换时，一般需要配套的仪器，并且对脱盐柱的柱效及处理具有一定的要求。使用脱盐柱对样品置换缓冲液时，还可以将样品中的小分子杂质及在培养细胞时添加在华体会体育最新地址 中的酚红去除(在pH>7时，酚红可以与阴离子交换填料结合)

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