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微生物菌种保藏

微生物菌种是我国非常重要的生物资源，随着微生物菌种越来越多的被应用到食品、饲料、医药等领域，其活性和稳定性变得越来越重要，因此对菌种保藏的要求也越来越高。本文结合一些文献文章，对常见微生物菌种保藏方法的优劣进行比较。

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菌种保藏基本原理

目前，菌种保藏有较多的方法，原理也是大同小异，基本都是依据微生物的种类和繁殖的生理生化特性进行的。通过对温度、湿度、氧气等条件的控制，使微生物生长代谢活动受到抑制，生长繁殖暂时处于休眠的状态，既保证菌种不死、不衰、不变，又使其代谢处于最低状态，同时保持菌种本身应有的特性。好的保藏方法既要考虑方法的经济性，又要考虑到简便性，以利于在生产和工作中方便应用。因此，应根据不同菌种的特点以及需求，选择合适的保藏方法。

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微生物菌种常用保藏方法

定期移植法

此方法有时也称为传代培养法，该方法是一般微生物实验室经常使用的保藏方法之一。根据不同微生物生长繁殖所需条件的不同，将需要保藏的菌种接种至适宜的斜面或者液体华体会体育最新地址中，在适当温度条件下培养至所需时间，生长充分以后，于4℃～6℃条件下保存，保藏时间一般为4个月～6个月，隔一段时间进行一次传代培养，但对于副溶血性弧菌等弧菌不可采用冷藏方法进行保藏。此方法为实验室和工厂菌种室常用的保藏方法。

优点：操作简单，一般微生物从业人员均可顺利完成，使用方便，基本不需要特殊设备仪器，成本较低，观察方便，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等，应用范围广。

缺点：工作强度大，无法长时间保存，需要频繁进行传代移植，且在移植过程中极易造成污染和菌种的退化，影响微生物的性状。

矿物油保藏法

此方法也被称之为液体石蜡覆盖保藏法，是传代培养的辅助方式。此方法的原理是在已经长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌体与空气隔绝，从而使菌体处于生长和代谢停止状态,同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求在-4℃—4℃下。

优点：操作简便，使用方便，可以防止因华体会体育最新地址水分蒸发而引起菌种死亡，可以阻止氧气进入以减弱代谢作用，保存时间较长，可以达到2年～10年。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1-2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。

缺点：对人员操作水平有一定要求，且操作强度大，成本高。在使用矿物油时要注意防止污染和防范火灾，且直立的试管对存放空间有较高的要求，携带十分不便。

载体保藏法

此方法又称为干燥保藏法，是将微生物吸附在适当的载体上，一般会依据选择载体的不同，最常采用沙土管、明胶片、滤纸保藏法。

优点：操作简便，所需仪器设备简单，而且便于携带。

缺点：对营养细胞不适用，使用范围相对较窄。

该方法对于产孢子或有芽孢的霉菌和放线菌都可以用这种方法进行保藏。细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14-17年之久。

液氮冷液保藏法

此方法有时也称为液氮超低温冻结保藏法。是将悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移至-196℃的液氮或-150℃的液氮气相中保存的方法。方法要求配备一些专用设备，如液氮冰箱、液氮储藏器等，需要使用甘油、吐温80等保护剂。

优点：菌种保藏时间较长，菌种存活率高，且不易发生变异及退化。

缺点：操作相对复杂，对人员操作水平要求高；设备昂贵，需要定期补充液氮，保藏成本高。同时需注意防爆危险的发生。

此方法适用于支原体、衣原体等采用冷冻干燥法难以保藏的菌种，是很多菌种保藏机构选择较多的方法。

真空冷冻干燥保藏法

此方法是指将需要保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经过真空封存后进行保存的保藏方法。此方法可克服简单保藏方法的不足。可充分利用对菌种保藏的有利因素，使微生物菌种始终处于低温、干燥、缺氧的条件下，因而它是时至今日最有效的菌种保藏法之一。此方法的原理是将冷冻的培养物在减压状态下进行真空干燥，使菌种处于不利于其生长繁殖的环境。对于好氧菌和厌氧菌的保藏，主要操作程序基本相同，但需要注意保护剂的选择。

优点：保存期限长，可达到 10 年以上，且携带、运输方便，菌种的存活率和稳定性均较高。

缺点：对设备要求高，需要专业的真空冷冻干燥设备，投入相对较高；对人员操作水平要求高，操作方法相对繁琐，通常专业化的菌种保藏机构选用此种方法；冷冻干燥过程对菌体有一定损伤，需进行恢复培养。

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脱脂奶粉作为保护剂

脱脂奶粉作为保护剂制备简单，可通过凝乳鉴定生长时期且保存期长。对于冻干菌种时也通常采用脱脂乳做为冻干保护剂，脱脂乳是大分子物质，对菌体具有很好的保护效果。

脱脂奶粉与全脂奶粉对比：脱脂奶粉的主要成分是蛋白质和糖类，其中蛋白质的直径在1nm～2nm之间，其水溶液是胶体溶液，蛋白质分子比细菌小得多，所以细菌颗粒处于蛋白质分子的包围之中，既可阻止菌体聚合，又有利于吸收和转化，保持细菌活性。而全脂奶粉中含有脂肪，在细菌保存中会形成酸败，导致细菌活性的降低或丧失。

脱脂奶粉作为保护剂，在菌种进行恢复培养时，可以为菌种提供所需要的营养物质（比如蛋白质和糖分），而其他的保护剂则是没有。

真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。

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结束语

关于微生物菌种保藏的新方法不断涌现，需要根据菌种的不同特性进行选择。我国对于微生物菌种保藏的研究起步相对较晚，科研基础相对薄弱，需要业内人员积极努力探索找寻更有利于推广的保藏技术，在保证菌种特性稳定的基础上探索更经济更便捷的保藏方法。

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