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春雷霉素的应用领域

主要用于喷雾和灌根,于发病初期开始用药,7-10天后第2次用药,共用2次即可。

(1)防治黄瓜炭疽病、细菌性角斑病,用2%水剂400- 750倍液喷雾。

(2)防治西红柿叶霉病、灰霉病,甘蓝黑腐病,用2%水剂550-1000倍液喷雾。

(3)防治黄瓜枯萎病,用2%水剂50-100倍液灌根,喷根颈部或喷淋病部。

(4)防治水稻稻瘟病,用2%水剂500-600倍液喷雾,7-10天后第2次用药。

(5)春雷霉素是防治多种细菌和真菌性病害的理想药剂,有预防、治疗、生长调剂功能。它既是防治稻瘟病的专用抗生素外,还对水稻细条病,柑橘流胶病,砂皮病,猕猴桃溃疡病,辣椒细菌性疮痂病,芹菜早疫病,菜豆昏枯病,菱白胡麻斑病等有好的防治效果。

春雷霉素的结构

由春雷链霉菌产生的春雷霉素属于氨基糖苷类抗生素,春雷霉素的化学结构包括氨基糖骨架 kasugamine、肌醇和二碳单元侧链。

氨基糖苷类抗生素化合物根据化学结构的不同可以分为不同的类别,它的结构基本骨架都是肌醇的衍生物,在肌醇的基础上至少连接一个氨基糖,整个化学结构中含有大量的自由羟基和氨基基团,而在自由羟基和氨基基团上还能进行进一步的修饰。

第一类被发现的氨基糖苷类抗生素链霉素由一个双糖单元连接到胍基化的链霉胺单元的 4 位上而形成的,属于这一类的氨基糖苷类抗生素较少。大量的氨基糖苷类抗生素属于第二类,这一类氨基糖苷类抗生素含有 2-脱氧链霉胺的核心骨架,它们都是通过在巴龙霉胺的基础上进行生物合成衍生来的,包括卡那霉素类、新霉素类和庆大霉素类。其他不来源于巴龙霉胺的氨基糖苷类抗生素包括潮霉素、安普霉素和大量的不同类型的假二糖。潮霉素和安普霉素都以 2-脱氧链霉胺作为核心骨架,只是在 5 位和 4 位上发生相应的取代。而假二糖类别的抗生素,如壮观霉素、春雷霉素、fortimicins、istamycins 和 sporamycins 等,含有大量被不同单元替代的肌醇。

春雷霉素的杀菌机制

关于氨基糖苷类抗生素如何穿透细胞膜到达作用靶标的机制仍然不是很清楚,但是大量的研究以链霉素和庆大霉素为模型分析了它们进入细胞的方式。随着人们对蛋白质合成过程生物化学机理的理解加深以及翻译忠实性的分子机制的认识,氨基糖苷类抗生素的作用方式也有了新的认识。在 30S 核糖体亚基的 A位点重要的组成部分包括一个不对称的内环,这个内环由三个腺苷组成,分别是1408 位,1492 位和 1493 位。氨基糖苷类抗生素结合在 30S 核糖体亚基的 A位点稳定了内环结构,使得 1492 位和 1493 位翻转到内环结构外,从而有利于其他非同源的 tRNA 结合到这个位点从而导致 mRNA 的错读从而合成错误的蛋白。尽管所有 2-脱氧链霉胺为骨架的氨基糖苷类抗生素和 30S 核糖体亚基的 A位点的相互作用是高度保守的,但是每一个氨基糖苷类抗生素在转位的过程中对核糖体的动态结构的影响不同。现在已经有大量的氨基糖苷类抗生素与核糖体作用的晶体结构得到解析,包括巴龙霉素和链霉素

2006 年 Schuwirth 等通过 X 射线衍射技术研究了春雷霉素与核糖体的作用方式,最终他们得到了春雷霉素与核糖体 70S 亚基结合的结构。通过结构解析揭示春雷霉素占据了核糖体 P 位点和 E 位点的 mRNA 通道。因此春雷霉素通过直接干扰 m RNA 与位于起始密码子上游序列的结合来发挥抑菌机制。

春雷霉素发酵特点

4.1

春雷霉素发酵的菌株改良

此研究过程中选用载体 pJTU2554 作为构建文库的载体,宿主菌是 XL1-Blue MR。整个基因组文库的构建过程可以分为五个部分:

(1)质粒载体的制备,

(2)链霉菌基因组的制备以及部分酶切,

(3)回收片段与载体的连接,

(4)连接产物的包装,

(5)包装产物的转染。

此实验使用经典的盐析法提取链霉菌的基因组DNA,然后溶解在适当体积的TE溶液中。取出 5ul 的基因组 DNA 使用1%的琼脂糖凝胶进行脉冲场电泳(PFGE),从而检测提取的基因组 DNA 的质量。然后取少量的 DNA用仪器 Nanodrop 2000 检测总 DNA 的浓度和纯度,当达到要求后对提取的基因组 DNA 进行适当稀释后用于后续的部分酶切实验。

利用kasE编码的酶推测催化磷酸肌醇到肌醇的水解反应,能够为春雷霉素的生物合成提供前体肌醇的供应。此次实验成功地利用整合型载体将受红霉素启动子控制的 kasE 基因引入到高产菌株的染色体上构建了 kasE 基因加倍的突变株。同时也成功构建了整个春雷霉素生物合成基因簇加倍的突变株。但是令人不解的是,kasE 基因加倍的突变株和整个春雷霉素生物合成基因簇加倍的突变株发酵后春雷霉素产量都没有得到明显的提高。

此次研究说明我们需要更清楚地了解高产菌株高产的机制,针对高产菌株高产的原因寻找更有效的改造靶标。

4.2

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4.2.1用于培养大肠杆菌的华体会体育最新地址

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4.2.2用于链霉菌液体培养的华体会体育最新地址

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4.2.3小金色链霉菌的产孢华体会体育最新地址

先称取黄豆饼粉 12.5 g,加适量自来水灭菌后用六层纱布过滤除渣。然后向过滤后的溶液中加入NaCl 2.5 g,甘油12.5g,蛋白胨3 g 最后用自来水定容至 1 L,调节 pH 7.2-7.4。分装到 1000mL 三角瓶,每瓶装 400 mL,分别加入琼脂 8g,CaCO3 0.8 g,121℃灭菌 25 min。

4.2.4小金色链霉菌的发酵种子华体会体育最新地址

黄豆饼粉 10g,葡萄糖 10g,NaCl3g,KH2PO41g,豆油 5mL,牛肉膏 5 g,自来水定容至 1L,调节 pH 至 6.8,分装到 250mL 的弹簧三角瓶,每瓶 20mL,115℃灭菌 30min。

4.2.5小金色链霉菌的发酵华体会体育最新地址

玉米淀粉 20g,充分糊化后再加入黄豆饼粉 50g,鱼粉 15g,葡萄糖 10g,NaCl 1g,KH2PO4 0.1g,豆油 25mL,自来水定容至 1L,70℃烘箱放置 30min,然后分装到带弹簧的三角瓶,每瓶 50mL,115℃灭菌 30min。

4.3

春雷霉素的一般发酵工艺描述

取少量小金色链霉菌及其相关突变株的孢子划线于产孢华体会体育最新地址上,待它们充分产孢后接种等面积的菌块于含有 20ml 春雷霉素种子华体会体育最新地址的装有弹簧的250ml 锥形瓶中。在 30℃摇床中振荡培养 28h 后转接等量的种子培养液于含有50ml 春雷霉素发酵华体会体育最新地址的装有弹簧的 500ml 锥形瓶中,置于 30℃摇床,转速为 220r/min,发酵 7 天。

4.4

春雷霉素的提取工艺

收集 1ml 发酵箘液于离心管中 12000rpm 离心 5min,转移上清于新的离心管中,然后用 1ml 注射器吸取上清通过滤膜过滤后将过滤后的样品保存在-20℃冰箱中。

春雷霉素的研究现状

5.1

春雷霉素合成基因簇

关于春雷霉素的生物合成研究,Kiyoshi 等利用经典遗传学方法,率先从春雷霉素产生菌中克隆到春雷霉素抗性基因 kac273(kacH 或 kacH1);之后,Ikeno 等利用该基因为探针从春日链霉菌M338-M1 中克隆到一个 7. 6 kb 的片段,序列分析显示该片段含有 9 个与春雷霉素生物合成相关的基因,其中部分基因负责春雷胺的合成。

5.2

春雷霉素生物合成途径

有关春雷霉素的生物合成途径,早期同位素喂养实验证实其结构中春雷胺单元来源于葡萄糖胺,而二碳侧链及 D-肌醇两个单元的合成前体分别为 L-甘氨酸和肌醇(myo-inositol)。在此基础上,Flatt 等又根据生物合成基因簇的研究及生物信息学分析,粗略推断了春雷霉素的生物合成途径。与此同时,Jo 等以 kasA 为探针从构建的 Fosmid 基因组文库中克隆出 22 kb 与春雷霉素生物合成相关的 DNA 区域,其中含有 17 个完整的春雷霉素生物合成基因,而 kasD 则有助于研究春雷霉素合成的前体物质;然而此后春雷霉素的生物合成研究却陷于停滞状态。

5.3

春雷霉素产量的研究

Kim 等研究发现,通过改变并控制春雷霉素发酵过程中的 pH 可以有效提高春雷霉素产量;随后,Kim 等采用固定化细胞培养技术,使春雷霉素的连续发酵时间持续 820 h,高产春雷霉素可达到 9. 8 mg /(L·h)到 16. 1 mg /(L·h)的生产范围,是非固定化技术的 14 倍到 23 倍;Cho 等通过紫外诱导原生质体获得耐亚油酸华体会体育最新地址的突变株SK-12,发现在发酵 6d 后春雷霉素产量可达到1. 2 g /L,产量高于未突变亲本的 5 倍。