在使用镍柱蛋白纯化时，经常会出现各种各样的问题，如纯化的蛋白中杂质含量高，纯度低；样品过镍柱进行纯化时，柱子变为棕色；纯化样品时柱子反压过高，出现层析柱堵塞现象；纯化过程中蛋白发生了沉淀；纯化时蛋白不挂柱或者挂柱的蛋白不能被洗脱下来等。本文针对这些蛋白纯化常见的问题作一分析并给出常用的解决方法。

1. 如何处理样品，可使其初步提纯？

①上清样品处理，要加入去污剂，蛋白酶抑制剂，还原剂，还要注意温度及超声破碎的参数。

②去除大肠杆菌自身表达的蛋白（两条 30KD-40KD），可用非变性缓冲液超声悬浮（可加入去垢剂），离心 6000r/min,30min,4~10℃。

③大肠杆菌包涵体的洗涤，可用包涵体洗液多洗几遍，也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解，摸索出其中纯度最佳的浓度。

④可用硫酸铵沉淀法进行初步提纯。

①如果纯化的是上清，蛋白酶会部分降解目的蛋白，可通过加多种蛋白酶抑制剂(如PMSF)改进。

②可提结合缓冲液中的咪唑浓度，以降低镍柱对杂蛋白非特异性结合。

③杂蛋白与目的蛋白发生了结合，可通过超声前加入去垢剂的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。

④适当减少填料的使用量，因为加入过量的填料更容易对杂质产生非特异性吸附，造成纯度的降低。

⑤将Ni-IDA或Ni-NTA填料更换为Ni-TED填料；或者使用DETA对Ni-IDA或Ni-NTA填料进行脱镍，然后螯合Co2+，将介质更换为Co-IDA或Co-NTA填料进行样品的纯化。

3. 镍柱堵了怎么办？

①柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其它杂质颗粒所致，所以样品上样前要经过高速离心和过滤处理。

②在纯化时，蛋白发生变性，有絮状物产生，可尝试加入 1-2mM DTT (上清样品处理要在冰浴中进行)，如果不能解决絮状物的产生，可以适当添加尿素(如添加终浓度为2M的尿素)阻止蛋白的凝聚。

③样品处理时的适当增加溶液的体积，否则黏度大，通常建议1g的菌体加入10~15mL的溶液为宜。

4. 镍柱使用中出现棕色是怎么回事?

5. 纯化过程中，蛋白出现了浑浊，怎么办？

①出现浑浊，说明蛋白处在不稳定的环境中或者蛋白本身性质就不稳定，所以要检查缓冲体系是否正确，环境温度是否合适，或在缓冲液中加入低浓度的还原剂如DTT。

②加入肌氨酸钠，迅速使蛋白变性，消除浑浊现象。

6. 没能纯化到带 His 标签的蛋白，蛋白不能挂柱？

①超声的功率不对(太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放) ；

※应对方法：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶。

②样品的结合缓冲液选择不正确 ；

※应对方法：检测缓冲液的 pH 及样品和结合缓冲液的组成分（是否误加了EDTA，EGTA等螯合剂）。

③组氨酸的标签没有完全的暴露 ；

※应对方法：在变性条件下(如添加8M 尿素，6M 盐酸胍，1%SDS)，此外加入 1-2mMDTT 进行纯化。

④His 标签丢失；

※应对方法 1：WB 或者 anti-his 的抗体检查 His 是否表达，上游构建，改变his-tag 的位(C-terminal or N-terminal)，必要时增加 his 个数(常用 6-10 个)；

※应对方法2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间；

※应对方法 3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子，如Cu2+，Zn2+，Co2+等。

7. 蛋白挂在柱子上洗脱不下来,怎么解决？

①洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）

※应对方法：增加洗脱液中咪唑的浓度

②采用降低PH的方法洗脱，但应注意当PH低于 3.5,会导致镍离子脱落，因此使用此方法时不应将PH值降的过低

③蛋白在层析柱发生了沉淀

※应对方法：减少上样量和孵育的时间，添加去污剂(1%-2%Tritonx-100)或改变 NaCl 的浓度，或者在变性条件下进行洗脱(如用 8M尿素，或 6M 盐酸胍)，也可尝试在洗脱Buffer中加入 2mMDTT 或者 0.5%肌氨酸钠进行洗脱。

④非特异性疏水结合或其他相互作用

※应对方法：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加 NaCl 的浓度。