内毒素(Endotoxin)是一种脂多糖(LPS)，来源于革兰氏阴性细菌外膜，其细胞壁外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成，细胞死亡或分解后被释放出来。LPS具有三个结构，由菌体特异性多糖、非特异性核心多糖和脂质A三部分构成(结构如下图)。内毒素单体分子量为10kDa左右，在不同成分水溶液中，可形成大分子聚集体，最大可超过1000 kDa。类脂A是内毒素多种生物活性或毒性反应的主要基团。该基团没有种属特异性, 所以各属细菌的类脂A 结构相似, 其毒性反应相似，如发热、血液流动力学改变、弥漫性血管内凝血, 并导致休克等。O-特异多糖位于菌体胞壁的最外层，由若干重复的寡糖单位组成。多糖的种类与含量决定着细菌种、型的特异性，以及不同细菌间具有的共同抗原性。它还参与细菌的抗补体溶解作用。

内毒素不是蛋白质, 热稳定性强。在 100℃的高温下加热1h 也不会被破坏, 115℃30m in 湿热仅能破坏 25% 左右的热原质。只有 180℃ 3～ 4h 或 250℃ 1～ 2h 干烤, 或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸 30min才能破坏它的生物活性。

内毒素带有负电荷, 由于脂多糖结构中类脂 A 的疏水性, 使得内毒素倾向于以高分子聚合物的状态存在而难溶于水, 并由于环境中 Ca2+、Mg2+等被吸引到带负电荷的脂多糖上而得以稳定。通常其分子量几十万至上千万道尔顿。

内毒素存在形式:单体，胶束，囊状

内毒素的产生：

基因工程蛋白通常采用细菌、酵母、哺乳动物细胞或昆虫细胞作为宿主进行大规模发酵生产, 但大多是以大肠菌作为表达系统。以大肠杆菌作为表达系统的蛋白通常都是在胞内表达, 在纯化蛋白之前必须通过高压匀浆、超声波破碎或低压渗透等方法将菌种破壁, 以释放蛋白。同时细胞壁内的脂多糖也大量释放到缓冲液中, 通常 10% 的湿菌浓度可产生几万EU/mL 的内毒素, 这是内毒素的主要来源。

对于酵母表达系统或 CHO (中国仓鼠卵巢细胞系) 系统等, 虽然表达系统本身不产生内毒素, 但在生产过程中因原辅材料, 生产环境以及个人操作等因素造成产品内毒素污染, 这是产生内毒素的另一来源。

在生产过程中如何防止内毒素污染：

①粗纯中防止内毒素污染 无论是酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞表达系统还是大肠杆菌表达系统, 在生产过程中以各种途径利用各种方法有效地防止内毒素污染均是非常重要的。前者本身不产生内毒素, 只要在生产过程中能有效防止内毒素的污染, 就可以得到热原合格的产品; 后者虽然不可避免地产生内毒素, 但通常在初步纯化中已采取有效措施, 可以大量减少内毒素含量。

②通过无菌操作和控制操作区洁净度来防止外源性内毒素污染。首先, 生产车间必须是符合 GMP要求的洁净厂房, 各种不同的操作在不同的洁净区内进行, 例如发酵和粗纯应该在十万级区进行, 精纯在万级区域内进行, 制剂、分装须在百级间或层流罩下进行操作。对于任何非封闭系统的操作, 均应采取无菌操作方式, 如果系统自动化程度较高, 可遥控操作或较少手工操作。

③对于任何直接接触制品的溶液、容器、生产用具、管路、生产系统等必须进行严格有效的处理, 去除热原。用蒸馏法或反渗法制备的新鲜注射用水或灭菌注射用水通常都是无热原的, 这是清洗器具及配制溶液的基础。生产器具一类是玻璃器皿, 不锈钢制品, 这些器具可置180℃ 3～ 4h 或 250℃ 1～ 2h干烤, 除去热原。另一类为橡胶、塑料制品, 如胶塞、胶管等, 可采用 0.1M盐酸煮沸30min, 或 0.1M氢氧化钠浸泡 4h以上, 急用时可煮沸30min, 然后用新鲜注射用水冲洗净, 再高压灭菌。对于生物制药的某些关键步骤可采用无菌、无热原的一次性器具, 既可以减轻劳动量, 又可以防止清洗不净带来的污染。溶液配制要使用无热原的新鲜注射用水, 整个过程必须于 3h 内完成, 并及时高压灭菌。对于一些不能灭菌的溶液, 可通过超滤法除热原。如(PBS) 在高压灭菌时会产生具有紫外吸收的焦磷酸, 在使用磷酸盐液缓液(PBS) 进行柱层析时, 就对层析图谱产生干扰, 在干扰素的生产与检定中曾经出现过这样的问题, 采用截留相对分子质量 (NMWL ) 为 10kDa的超滤膜超滤可有效去除溶液中的热原。

生物技术药品的生产中, 对于系统、管路的清洗涉及在位清洗(CIP)/在位灭菌(SIP)的概念主要是针对泵、管道、阀门、滤器、柱、各种罐等需定期清洗灭菌的设备,常规要求在不拆卸任何组件的情况下原位进行。例如层析系统,它是生物技术药品生产中最普遍使用的单元操作,在清洗/在位灭菌十分重要,有效的在位清可以减少产品污染的危险性、维持柱效和提高介质寿命。氢氧化钠被经常用作在位清洗时的清洗液。

细菌内毒素的检测：

细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素, 以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。鲎试剂法的反应机理是细菌内毒素在二价阳离子参与下激活鲎血细胞溶解物中的一系列凝聚酶的反应。其包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质 法。检测时可用其中任一种方法，当结果有争议时，另有规定外，以凝胶法结果为准。鲎试剂法具有简便、迅速、定量准确、灵敏度高等优点，在国际上受到广泛应用，已被美国、欧洲、日本等国《药典》及《生 物制品规程》收载，我国2005年版药典也已收载，应用于药品、生物制品的热原检定。

细菌内毒素的去除：

由于内毒素显著的危害性，FDA等法规也对内毒素的控制和将其降低到安全水平提出明确要求。无菌操作和操作区洁净度也是控制外源性内毒素污染的有效手段。然而对于样品本身就存在的内源性内毒素污染，即使外源性内毒素得到有效控制，最终工艺制备的样品也存在内毒素超标的风险。那么就需要从样品本身制备工艺角度，结合内毒素特点，寻找有效方法，使样品本身内毒素(Endotoxin)降低，达到工艺要求，提高产品安全性。
①疏水层洗法：一般来说内毒素的疏水性都是远远大于目标物的，因此在疏水层析上样需要高盐缓冲液平衡，内毒素在高盐下发生凝集，不结合疏水介质，因而上样时直接穿透而被去除。或者采取目标样品流穿模式，在一定盐浓度下使目的蛋白不结合填料，而内毒素分子可与填料结合，使两者实现分离。

②离子交换法：对于阴离子交换层析，内毒素在 pH>2时带负电荷，与阴离子交换介质Q或DEAE有较强结合, 可使用目标蛋白从阴离子交换填料流穿的方式去除内毒素；也可在目标蛋白和内毒素同时结合于层析介质上后，由于内毒素的结合能力较蛋白的结合能力强，因此可先将目标蛋白洗脱出来，然后再用高盐缓冲液或NaOH将内毒素洗出。对于阳离子交换层析，在pH4.0时，内毒素还是带有负电荷不能和填料结合而随流动相流出层析柱，目标蛋白则可以与阳离子交换介质结合，因此采用阳离子交换层析也可以很好的去除内毒素。此外，采用一些表面活性剂比如Triton X-114，既能阻止内毒素结合在阴离子柱上也可阻止内毒素结合在阳离子柱上。

③凝胶过滤层析：内毒素可在水溶液中以非极性和离子相互作用，形成大小为 1,000 kDa 分子聚集体，它与多数生物蛋白分子量差异较大，基于这一特征，可以采用凝胶过滤层析，将大分子内毒素分子与目标蛋白分离。但其处理量小, 处理时间较长。

④TFF切向流技术去除内毒素：内毒素在不同的水溶液中，常形成聚集体结构，因其聚集的程度不同，分子大小不一。小聚集体分子量为10~20 kDa，而大聚集体的分子量可达1000 kDa。使用切向流膜孔径小于内毒素的分子量而使内毒素分子截留，目标样品透过膜孔，达到去除样品中内毒素的目的。影响蛋白溶液中内毒素去除因素主要包括，目标分子的大小分布、内毒素与目标分子的相互作用、目标蛋白质浓度以及是否添加相应的洗涤剂。

⑤通过亲合层析去除内毒素: 亲合层析技术, 特别是免疫吸附剂在生产中的运用使得生物大分子的纯化变得简单。免疫吸附的原理基于抗原、抗体的特异性作用, 以目标蛋白作为抗原, 将通过杂交瘤技术生产的单克隆抗体偶联于介质上, 以此介质来吸附目标蛋白。由于相互作用的高度特异性, 理论上仅有目标蛋白吸附于介质上, 内毒素全部穿透, 洗脱后将得到纯度很高的无热原产品。实际上, 由于介质本身存在的非特异性吸附, 仍有少量的杂蛋白和内毒素同时被吸附, 但内毒素含量是极低的。在干扰素(IFN)生产中, 洗脱物内毒素含量一般为0.25EU/mL。

⑥利用特异性吸附内毒素介质去除内毒素：将内毒素底物LAL或多粘菌素B(PMB)偶联于层析介质上, 以此介质特异性吸附内毒素, 而蛋白不会被该层析介质吸附随流动相流出，收集该流出蛋白即可。该方法去除内毒素效果较好, 但有一定的蛋白损失。

总的来说，目前还没有适用于生物制药工艺中去除内毒素的通用方案。尤其内毒素含量特别高的样品，单一方式去除效果不好时，需要结合不同生物制品和不同工艺的特点，考虑多种方式组合以降低工艺过程的内毒素杂质，提高产品安全性，从而满足相关法规要求。

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