枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种土壤来源的低G+C、内生孢子革兰氏阳性细菌，也是一种重要的原核表达宿主，具有很高的应用价值，其培养简单快速，具有较强的分泌蛋白质的能力、非致病性及良好的发酵基础和生产技术，是目前生产各种工业用酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等的理想表达宿主，是微生物研究领域中的一种重要模式菌株。目前，已经有很多外源基因在枯草芽孢杆菌系统中成功复制、表达，该表达系统的进一步开发将会带来更高效、更经济、更安全的应用价值。

1.枯草芽孢表达系统介绍

1.1枯草芽孢杆菌菌株发酵优缺点

相较于传统的大肠杆菌表达系统，枯草芽孢杆菌的优势越来越明显，它作为基因工程菌的出发菌具有巨大潜力和优势：

（1）非致病性。枯草芽孢杆菌在自然界中广泛存在于动物肠道当中，被认为是肠道益生菌，有一定制备发酵食物的历史，不产制热致敏蛋白质和各种毒素，安全程度可以达到食品级。

（2）枯草芽孢杆菌细胞具有很强的蛋白质胞外分泌能力，大约有300多种蛋白质可以被直接分泌至胞外，相比较工业上常用的宿主菌大肠杆菌而言，简化甚至可以去除部分目的蛋白的纯化步骤。

（3）枯草芽孢杆菌表达系统表达的蛋白质产物不容易形成包涵体。在大肠杆菌表达系统中，如果待表达的外源蛋白质的编码序列含有大量连续的稀有密码子，那么表达水平通常偏低，甚至翻译提前终止；包涵体导致蛋白质不可溶，这使得难以分离和纯化目的蛋白质，但是枯草芽孢杆菌表达系统不存在以上问题，在这些方面表现出明显的优势。

（4）枯草芽孢杆菌是好氧嗜温菌，不需要制造无氧环境，也不需要特殊的华体会体育最新地址 ，培养周期短，生长速度快，发酵所需的华体会体育最新地址 配方简单，发酵技术成熟，易实现工业化应用。

然而，对于枯草芽孢杆菌表达系统的研究起步较晚，仍有很多需要人们继续探索的方面：

（1）尽管模式菌株的全基因组测序已经完成，但仍有近50％基因的功能尚不明确；

（2）自然界中能自发形成感受态细胞状态的菌株较少，感受态持续时间短，转化效率低，转化方法针对性较强；

（3）枯草芽孢杆菌内部存在限制性修复系统，重组质粒易不稳定，造成质粒丢失；

（4）自身胞外蛋白酶表达能力强，可能引起目的蛋白降解；

（5）拷贝数通常较低，蛋白表达量不高；

（6）芽孢杆菌菌株多样性高，其启动子复杂性高，目前己知的σ因子有14种之多，兼容性不强。

1.2枯草芽孢杆菌表达载体

常用的枯草芽孢杆菌表达载体分为三类：噬菌体载体、整合型质粒载体和自主复制型质粒载体，其中自主复制的质粒应用最多，整合型质粒能够有效解决重组质粒在宿主内不稳定、易丢失这一问题。

目前常用的质粒载体有：穿梭质粒载体pEB60，pUB18，pEB10和pWB980，整合型载体pMutin-GFP+，pSG115，pMutin4，pSG1156，详情见下表。

常见枯草芽孢杆菌质粒载体

1.3枯草芽孢杆菌启动子基本结构

1.3.1启动子结构

启动子是调控外源基因高效表达的关键元件，其位于转录起始位点（TSS）上游，可以供RNA聚合酶识别和结合，使酶与启动子形成二元复合物，从而与模板DNA准确结合并开始转录。原核启动子的核心区域为TSS上游200bp至下游100bp，该区域存在小段保守序列，如枯草芽孢杆菌sextama-35区（TTGACA）、Pri-bmow-10区（TATAAT），根据这些保守序列可以对启动子进行简单的预测和分析。枯草芽孢杆菌启动子核心区域的典型结构图：

枯草芽孢杆菌启动子核心区域的典型结构

1.3.2枯草芽孢杆菌启动子的σ因子

原核基因的RNA聚合酶由5个亚基组成，分别为α亚基、β亚基、β'亚基、ω因子和σ因子。σ因子能够协助核心酶识别特定启动子序列，以便结合于转录起始部位，σ因子与核心酶瞬时结合，二者的结合与分离为RNA聚合酶的重组提供机会，转录开始后σ因子就不再有作用。目前，已知的枯草芽孢杆菌σ因子有14种，每一种σ因子的功能和数量并不相同，其中含量最多的是σ^A因子，它是转录必须基因，是营养期最重要的σ因子，负责转录管家基因，相关基因数约358个，占σ因子总量的90%~95%，相当于大肠杆菌中的σ⁷⁰。

1.4.启动子的分类

对于重组蛋白的生产，启动子强弱直接决定了该蛋白的表达水平。根据不同启动子调控转录水平能力的不同，可以将其分为强启动子和弱启动子；根据启动子诱导机制的不同，又可以分为组成型启动子、诱导型启动子、时期特异性启动子和自诱导启动子。本文主要介绍的是枯草芽孢杆菌的组成型启动子和诱导型启动子。

1.4.1组成型启动子

组成型启动子又称非特异性启动子，是指不需要添加任何诱导物就可以持续表达目的蛋白的启动子，它的启动能力强，成本低，常被用于构建载体时的表达元件。常见的枯草芽孢杆菌组成型启动子有P43启动子和噬菌体启动子，其中P43被普遍应用于各种研究，是胞苷脱氨酶基因(cdd)的启动子，它是有σ^A和σ^B两个因子负责识别的重叠启动子。研究表明，组成型启动子P43的启动强度强于诱导型启动子P_amyE和P_sacB。

1.4.2诱导型启动子

诱导型启动子是指受环境变化或化学诱导来调控基因表达的启动子，在代谢工程中，可以针对不同诱导型启动子改变诱导剂的种类及浓度，实现目的基因不同强度的表达。诱导剂可以与阻遏蛋白Lac I结合，使之与操纵位点分离，致下游基因得到表达。

在枯草芽孢杆菌中最常见的诱导剂是IPTG、木糖和蔗糖。除此之外，Yang等构建的以诱导型启动子Pglv(Pglv-M1)为表达元件的表达系统也在枯草芽孢杆菌中得到广泛应用，该启动子以麦芽糖作为诱导物，价格低廉，安全无毒，且对代谢反应元件cre进行突变改造后获得的新启动子Pglv-M1受到葡萄糖的抑制作用大大降低，工业应用价值较大。

1.5通过启动子改造实现基因高效表达

1.5.1启动子的克隆

目前，针对启动子的克隆方法主要有三种，一是启动子探针载体筛选法，二是PCR技术克隆法，三是软件分析法。

利用探针型载体筛选、克隆启动子是指通过限制性内切酶随机切割外源ＤＮＡ得到不同大小的核苷酸片段（拟启动子片段），将这些片段连接到含有互补粘性末端的载体上，检测下游报告基因的表达活性，以判断拟启动子片段的转录活性。

构建启动子探针型质粒载体常见的报告基因有绿色荧光蛋白报告基因、荧光素酶基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因等。

软件分析法是通过现有数据库进行比对和大数据分析，常见的分析平台有Sofiberry等,可以对一段序列进行是否存在启动子的判断及位置分析，同时还可以模拟启动子能力强弱,方便快捷，但是基于现有数据库的分析可能存在一定误差，还需要后续实验进一步验证。

1.5.2改造启动子以实现目的基因的高效表达

目前大多用于外源表达的启动子为天然启动子，启动子起始转录能力的强弱与其自身结构有很大关系。常见的启动子改造办法有以下几种：构建复合启动子；启动子核心保守区域替换杂交；启动了保守序列突变等。

（1）构建复合启动子

自然界中，除了单个启动子作用于一个基因的情况，还存在复合启动子作用于一个基因的情况，如双启动子或者重叠启动子等。复合启动子可以提供更多的RNA聚合酶结合位点，使外源基因的转录水平高于单启动子。用于表达B-环糊精糖基转移酶的复合启动子Hpa-Panye-表达系统的表达量是单启动子Pay，表达系统表达量的1.3倍。

（2）启动子核心保守区域替换杂交

枯草芽孢杆菌启动子的核心保守区域有sextama-35区和Pri-bmow-10区，它们的典型序列是TTGACA和TATAAT。-35区和-10区分别是识别和结合RNA聚合酶的区域，不同启动子这两个区域对RNA聚合酶的识别、结合能力可能略有不同，若将不同启动子的强识别或强结合的优势区域组合替换杂交，使其进行优势互补形成最具优势的核心区域，则会更好的开始转录。

2. 枯草芽孢杆菌表达系统应用进展

枯草芽孢杆菌的研究无论在理论还是产品应用开发等方面均已取得巨大成功，如工业发酵、传统发酵食品制备和植物病害生物防治等。

2.1枯草芽孢杆菌在工业上的应用

枯草芽孢杆菌培养成本低、耗费时间少且有利于环境，是一种重要的表达宿主，既是有益菌，又是表达外源蛋白的工具，已广泛用于合成生物学、代谢工程和工业酶的生产。重组枯草芽孢杆菌的发酵能力强，在大规模发酵中表现出特有的潜力，通过对发酵条件进行优化，已证明枯草芽孢杆菌 WB600 可以作为生产 BglTO 的合适宿主，其产物活性与已有商业酶相比更高效，有望在酿造工业中应用。此外，β-甘露聚糖酶、胰蛋白酶、转谷氨酰胺酶(MTG)、有机溶剂耐受蛋白酶(OSP)、杜纳糖等多种工业产品均已成功在枯草芽孢杆菌中表达。

2.2枯草芽孢杆菌在农业上的应用

枯草芽孢杆菌对人类是安全的，被界定为“GRAS”(Generally Ｒecognized as Safe)，其在工业生产、疫苗开发、环境保护和肽库构建中都起到重要作用。将枯草芽孢杆菌 MF497446 施用到受镉(Cd)污染的土壤中，可促进植物生长并消除(或至少减少)农作物中 Cd 的积累，确保食品安全，降低人类健康风险。作为安全宿主，在枯草芽孢杆菌168中通过表达GGT(γ-谷氨酰转肽酶)可以提高茶氨酸的产量。

2.3枯草芽孢杆菌在医学上的应用

枯草芽孢杆菌在生产具有药理活性的重组蛋白方面具有多种优势，如质量和效率、安全性和分泌能力等，因此优于大肠杆菌。枯草芽孢杆菌是一种具有益生菌特性的内生孢子和生物膜形成细菌，其芽孢具有独特的物理、化学以及生化特性，是口服疫苗递送的强大平台。通过构建一系列重组枯草芽孢杆菌菌株，测试了口服芽孢后狗的免疫应答能力，并据此建立了枯草芽孢杆菌用作肠道疫苗制剂的主要步骤。研究也已证明枯草芽孢杆菌芽孢的口服递送可抵抗草鱼呼肠孤病毒感染。

3.总结

枯草芽孢杆菌是科学研究中的重要模式菌种，是一种具有极高研发潜力的微生物，其安全系数高、对环境无污染、高效且应用广泛，现已逐渐发展成生物技术领域的热点。随着基础研究和应用技术更深入的研究和推进，未来枯草芽孢杆菌将成为一个超级分泌细胞工厂。

未经允许不得转载：hth网页入口»枯草芽孢杆菌表达系统（常见表达载体、启动子的结构与分类、启动子的改造）及其应用