• PCR技术的原理

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍

• PCR系统的基本要素

PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg²⁺）。

• 提高PCR反应特异性的措施

PCR特异性 (specificity)是指PCR反应的产物只产生预期的靶序列，不含非目标靶序列的DNA片段。理想的PCR反应除了忠实性高，还应该体现为高度特异性和高效性，高效性是指经过相对较少的PCR循环能获得更多的产物。提高，PCR反应的特异性的措施有以下几方面:

1. 引物设计引物长度适当，一般为18~24bp，并保证序列独特性，以降低序列在非目的片段中存在的可能性。长度大于24bp的引物并不意味着有更高的特异性，较长的序列可能会与错误配对序列杂交，反而降低特异性，而且长序列比短序列杂交慢，影响产量。引物的浓度会影响特异性，最佳的引物浓度一般在1~0.5umol/L，较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。

2提高退火温度PCR的退火温度

设定一般由引物Tm决定，退火温度一般设定为比引物的Tm低5C。在理想状态下，退火温度应足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合，因此，需要找到这个温度的均衡点。采用梯度PCR仪可以对PCR反应的退火温度进行优化筛选，确定特异性最好的退火温度。

3·合适的Mg2+浓度

较高的Mg2+浓度可以增加产量，但也会降低特异性，为了确定最佳浓度，可以将Mg2+浓度从1mmol/ L到3 mmol/ L， 以0.5mmol/L递增，进行最适Mg2浓度的测定。

4·添加PCR辅助剂

甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱等都可充当PCR的增强剂，其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区，但是增强剂浓度要适当，否则会降低PCR的产量。

5改进PCR策略

通过改进PCR策略，如采用巢式PCR、融合PCR

• PCR过程中常见问题及解决方式

1、PCR反应出现假阴性结果，无扩增条带原因?

1 )模板：

① 模板中含有杂蛋白质;

②在提取制备模板时丢失过多，量不够;

※ 在酶和引物质量好时，不出现扩增带，在程序固定不变的情况下，模板的质量不高。

2 )酶失活：

需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或电泳时忘记加溴乙锭。

3 )引物：

引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。对策为：

① 选定一个好的引物合成单位;

②引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

③引物设计不合理，如，引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

4 )物理原因：

变性对PCR 扩增来说相当重要，如，变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

2、PCR反应出现非特异性扩增带的原因与对策是什么?

PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。可能出现的原因有以下几点：

1)引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体;

2)Mg2+离子浓度过高、退火温度过低及PCR循环次数过多有关;

3)其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增;

4 ) 其对策有：

必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

3、PCR反应出现片状拖带或涂抹带原因?

1)PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

2 ) 其对策有：

①减少酶量，或调换另一来源的酶;

②减少dNTP的浓度。增加模板量，减少循环次数。

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