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一、基因治疗和基因载体

基因治疗是近10年来随着现代医学和分子生物学的发展而诞生的，是将DNA自身作为高效生物物质利用的一项医学技术。具体地说，基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞代替病人细胞中的遗传缺陷基因，或关闭、抑制异常表达的基因，以达到预防和医疗疾病目的的一种临床医疗技术。通常，该DNA是能够编码起治疗作用，破坏作用或者标记作用的蛋白质的双链DNA分子（dsDNA）。也可能是该DNA能与宿主细胞里的目标序列结合，通过阻止mRNA或者启动子来抑制特定基因表达的反义RNA或者单链DNA（ssDNA）。基因药物不但可用于治疗疾病，而且可用于预防疾病。DNA疫苗又称遗传疫苗或基因疫苗（genetic vaccination）,是近年来兴起的一种以重组DNA形式进行免疫的新技术。DNA疫苗以重组DNA为基础，将外源基因重组于适当的表达载体，此基因在特定的启动子调控下得以表达。

基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定序列。将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，目前基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法。外源基因只有整合到染色体中，变为其中一部分才有可能得到持续的高表达。一个理想的基因载体应有以下特性：①能自主复制，即使外源DNA插入后仍是如此；②具备可供选择的遗传标记，便于进行重组体筛选和鉴定；③分子量小、多拷贝、松驰控制型；④具有多种常用的限制性内切酶的单切点；⑤能插入较大的外源DNA片段；⑥具有容易操作的检测表型。

二、质粒DNA的稳定性

在重组菌的生成过程中，重组质粒DNA往往发生丢失。质粒丢失主要有分离不稳定和结构不稳定两种情况。分离不稳定是由于在重组菌的生长过程中发生重组基因的丢失造成的，结构不稳定是由于基因的突变造成的。对于具有分离不稳定的重组菌的培养，由于丢失重组质粒的细胞具有生长优势，因此在培养中的比例不断增大，从而严重影响质粒的生产。

三、生产质粒DNA的发酵工艺（重组大肠杆菌）

3.1 菌种和质粒

目前培养菌种大多采用大肠杆菌，质粒根据自己的需求购买。

3.2 主要原料及试剂

蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、各种酶、无水乙醇、甘油及其他化学原料等。

3.3 主要仪器

恒温摇床、恒温恒湿培养箱、灭菌锅、光度计、发酵罐、超净工作台等。

3.4 华体会体育最新地址 制备

种子华体会体育最新地址 、摇瓶发酵华体会体育最新地址 、优化的华体会体育最新地址 和发酵罐华体会体育最新地址 。

3.5 种子发酵培养

从甘油管内取50μL菌悬液接入装有50mL种子华体会体育最新地址 的250mL摇瓶中，150r/min，37℃振荡培养12h。

3.6 摇瓶发酵培养

吸取0.1mL种子发酵液至装有100mL发酵华体会体育最新地址 的500mL三角瓶中，37℃，150r/min振荡培养15h。

3.7 发酵罐发酵培养

采用2L的发酵罐，装入1.5L发酵罐华体会体育最新地址 ，37℃，接种量1%，通气量2L/min，溶氧30%，搅拌速率根据溶氧变化进行调节。发酵过程中流加消泡剂。

四、质粒DNA的提取方法

（1）质粒DNA的碱裂解法

（2）质粒DNA的色谱纯化发

五、存在问题及展望

（1）质粒的稳定性是质粒生产的重要指标，涉及到质粒具体的功能问题，同时质粒的稳定性机理比较复杂，在华体会体育最新地址 质和发酵工艺优化中，需要进一步对质粒的结构稳定性给予考察。

（2）实验结果表明氨基酸对质粒生产有较好的促进作用，需要进一步考察氨基酸对菌体生长及质粒产量的影响。

（3）进一步优化合成华体会体育最新地址 ，进行高密度发酵生产质粒。

（4）在摇瓶培养条件的优化中，可适当扩大某些影响因子，如接种量、溶解氧、温度等，这些因子可能也影响到质粒的产量和稳定性。

（5）发酵罐培养中菌体的生长状况比较复杂，针对本菌株的特殊性，需要进一步优化罐上培养条件，进行发酵罐放大实验。

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