组氨酸(His)标签重组蛋白纯化

原理：利用蛋白质表面的组氨酸标签可以与CO2+ ，Ni2+等过度金属离子形成配位作用，固定在层析填料上CO2+ ，Ni2+等过度金属离子能够从复杂组分中特异性吸附组氨酸标签的蛋白质，达到与其他蛋白分离的目的。

Ni2+与组氨酸标签蛋白结合主要是通过组氨酸的咪唑基中的N与Ni2+形成配位作用，如下图：

组氨酸标签的类型：

1.4~10个串联的His氨基酸，常用的是6×His

2.His-Asn-His-Asn-His-Asn-His-Asn-His-Asn-His-Asn 即6×HN

3.Lys-Asp-His-Leu-Ile-His-Asn-Val-His-Lys-Glu-His-Ala-His-Ala-His-Asn-Lys 即HAT

※可以和Ni2+等过度金属离子结合的氨基酸除组氨酸外，还有半胱氨酸(Cys)和色氨酸(Trp)

※过度金属离子与组氨酸标签结合强弱顺序为：

Cu2+>Ni2+>Zn2+>Co2+

纯化组氨酸标签层析填料的结构：

常用Ligand的种类

★红色标记的原子代表可以与过渡金属离子发生螯合的位点

四种配基的区别：

配基	与Ni离子螯合价位	结合组氨酸强弱	载量
IDA	3价	★★★	高
NTA	4价	★★	中
TALON	4价	★★	中
TED	5价	★	低

由于Ni离子一共有6个价位可以用于螯合，与配基螯合的价位多，那么可以与组氨酸标签螯合的价位就少，这就会造成载量及纯化出蛋白的纯度不同。一般来说，载量的提高会造成纯度的降低，因此实验时需要根据实验目的合理选择所需配基的填料。

一般来说四种配基的填料均可以耐受8M尿素和6M盐酸胍，可以在蛋白变性的条件下纯化蛋白

对于配基为IDA的Ni填料，在准备样品时，要避免使用还原剂，因为还原剂的存在会将Ni2+还原，使填料变为棕色，使填料丧失结合组氨酸标签蛋白的能力

对于配基为NTA和TALON的Ni填料，在准备样品时，可以添加低浓度的还原剂， 如5 mM DTE ，5 mM DTT ，20 mM b-mercaptoethanol ，5 mM TCEP ，10 mM reduced glutathione

对于配基为TED的Ni填料，不仅可以耐受较高浓度的还原剂，而且还可以耐受1M NaOH，100mM EDTA，该填料更适用于纯化真核细胞表达的组氨酸标签蛋白

His标签蛋白纯化的一般流程：

填料平衡：尽量和破碎菌体的缓冲液保持一致，经常使用是含300mM NaCl的50mM Tris或20mM 磷酸盐缓冲液，此外还可以加入终浓度为10~20mM咪唑以减少非特异性吸附

上样：根据样品的蛋白含量及使用填料的体积合理调节上样速度，一般来说样品从进入至填料至流出填料的保留时间应该在1min以上

洗杂：可以使用平衡缓冲液进行洗杂，也可以在平衡缓冲液的基础上适当增加咪唑的浓度进行洗杂，洗杂的体积一般不应小于5倍填料的体积，增加洗杂体积可以提高纯化蛋白的纯度

洗脱：可以使用线性洗脱，一般用于摸索洗脱条件；也可以使用分步洗脱，用于洗脱条件的优化；对于杂蛋白含量很少的样品，也可以直接一步洗脱

★对于各种类型的Ni层析填料，纯化过程各步骤的pH应控制在7~8之间

组氨酸蛋白纯化方案设计：

在填料的选择时，需要根据实验目的进行挑选，并且需要综合考虑表达量，样品的中杂质含量，样品中的还原剂及EDTA含量等

FAQ：

1.未收到目标蛋白

①蛋白表达量过低→优化表达条件或增加样品的上样量

②蛋白是包涵体表达→用8M尿素或6M盐酸胍溶解包涵体

③蛋白未能与填料结合直接流穿→减少样品及洗杂液中咪唑的浓度

④确认样品的pH处在7~8之间

⑤His标签没有暴露在蛋白的表面，不能与Ni离子结合→重新设计质粒，将His标签更换在蛋白序列的另一端

⑥处理样品时，蛋白酶已将蛋白分解→处理样品时加入蛋白酶抑制剂，如PMSF

⑦蛋白与填料结合太牢固→增加洗脱液中咪唑的浓度或采用降低洗脱液的pH进行洗脱

2.蛋白发生沉淀

①纯化过程温度过高→在低温条件下纯化

②蛋白形成聚集体→添加增溶试剂，如非离子型去污剂，甘油，或β-巯基乙醇

③填料结合的蛋白量过多，洗脱时蛋白浓度过高造成沉淀→更换低载量的填料

3.蛋白回收率低

①上样量超过填料的结合载量→增加填料的体积

②非特异性吸附过高→在样品和洗杂液中加入去污剂，加入有机溶剂或增加NaCl的浓度

③样品中的目标蛋白未能与填料结合→减少样品和洗杂液中咪唑的浓度

④蛋白的His标签未完全暴露，不能充分的与Ni离子结合→在样品中加入终浓度为2M的尿素或CHAPS

4.洗脱的蛋白纯度低

①杂蛋白较多→增加样品和洗杂液中咪唑的浓度；延长洗杂时间，增加洗杂体积；减少填料的使用量

②含有与填料结合力更强的杂蛋白→降低咪唑的浓度，使用分步洗脱的方式洗脱

③杂蛋白通过二硫键与目标蛋白结合在一起→在样品和洗杂液中加入不超过20mM的β-巯基乙醇(避免加入DTT)

④杂蛋白与目标蛋白通过静电相互作用结合→增加样品和洗杂液中的NaCl浓度

⑤目标蛋白发生了降解→在样品和洗杂液中加入蛋白酶抑制剂

⑥杂蛋白和目标蛋白均可以和填料产生特异性结合→需使用其他纯化方式进一步纯化(如离子交换层析，分子筛等)

⑦杂蛋白和目标蛋白通过疏水作用相互结合→样品和洗杂也中加入非离子型去污剂(TritonX-100，NP-40等，加

入量应<2%)或醇类

★遇到问题需要从多方面考虑原因，并且需要使用多种方法不停的尝试

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