GST标签重组蛋白纯化：

原理：利用层析填料上的还原型谷胱甘肽(GSH)可以与含有谷胱甘肽S转移酶(GST，分子量~26kDa)标签的重组蛋白特异性结合的性质，将重组蛋白从含有杂蛋白的溶液中分离出来

★一般来说，使用一步纯化出的GST标签蛋白纯度高于一步纯化出的His标签蛋白纯度。GST标签一般可以根据选择的表达载体使用PreScission Protease、Thrombin、 Factor Xa这三种酶进行切除

谷胱甘肽填料的结构如下：

1.大肠杆菌细胞质中可溶GST标签蛋白的纯化

①收集的大肠杆菌用平衡Buffer进行重悬(可以按照1g菌泥加入5~10ml的平衡液)，重悬菌体时，如果菌液粘稠，可以加入少许核酸酶，放于冰浴中，使用超声波破碎仪进行破碎菌体

Tip1：如纯化的蛋白对蛋白酶比较敏感，可以在破碎菌体时加入蛋白酶抑制剂，如PMSF

Tip2：可以添加少量的非离子型去污剂提高纯化纯度，如NP-40(加入量不超过总体的0.1%)

②超声破碎完成后，可以使用离心机对破碎液离心，一般离心条件为12000×g，4 ℃离心20min

③取离心后的上清液进行上柱纯化

2.对于分泌表达的GST标签蛋白纯化

①不含有GSH组分的培养液可以离心后取上清直接进行上柱纯化

②对于含有GSH组分的培养液可以先使用硫酸铵进行沉淀蛋白，在使用平衡buffer进行复溶，离心后上柱纯化

3.对于大肠杆菌细胞周质表达的GST标签蛋白纯化

需准备如下溶液

1） Buffer S：30mM Tris-HCl，20%蔗糖， pH8.0

2） 500mM EDTA

3） 5mM MgSO4

①根据菌体的重量(以1g菌体为例)，按照1g的菌体加入80mL的Buffer S，并加入160uL的500mM EDTA，轻轻搅拌10min

②8000×g， 4 ℃离心20min，弃上清，加入80mL的5mM MgSO4重悬沉淀，冰浴中搅拌溶解沉淀， 8000×g， 4 ℃离心20min

③取离心后的上清上柱纯化

4.对于大肠杆菌表达包涵体GST标签蛋白纯化

①收集的大肠杆菌用平衡Buffer进行重悬(可以按照1g菌泥加入5~10ml的平衡液)，重悬菌体时，如果菌液粘稠，可以加入少许核酸酶，放于冰浴中，使用超声波破碎仪进行破碎菌体

②5000×g， 4 ℃离心20min，弃上清，加入与上清相同体积的平衡Buffer次进行超声波破碎处理以使沉淀彻底重悬，再次离心

③加入所需的变性剂并使用适当的复性方法进行复性，将复性液装入透析袋中透析至平衡Buffer中

④透析后的蛋白溶液离心后取上清液上柱纯化

★复性后只有正确折叠的GST标签才能够与填料结合

使用层析柱纯化流程：

①根据预估样品中的GST标签蛋白总量，根据填料的载量计算并向层析柱中加入所需体积填料

②填料沉降至层析柱底部后，加入3倍以上填料体积的纯化水进行平衡填料，再加入5倍填料体积的平衡Buffer平衡填料

③去样品进行上样，样品从进入到流出层析填料的保留时间应>1min

④使用10倍填料体积的洗杂Buffer进行洗杂

⑤使用洗脱Buffer进行洗脱并收集洗脱液，在收集洗脱液时，建议分管进行收集，检测后再确定需要保留的洗脱液

纯化缓冲液的优化：

①缓冲液类型：10～20mM PBS; 50～100mM Tris-HCl;

②pH范围：pH 6.2～8.0;

③盐浓度： 140～400mM NaCl;

④还原剂：0 ～5 mM DTT; 0 ～2 mM glutathione

⑤添加剂：0% ～ 5% glycerol

⑥洗脱液：10~60mM GSH

一般来说，如果在流穿中发现有未结合的GST标签蛋白，可能的原因主要有GST标签在表达时没有能够正确折叠，不能与填料上的配基GSH结合，另外可能是上样的流速过快造成未能与填料上的配基GSH结合就已流出

填料的再生流程：

对于纯化同一种蛋白，填料可以使用三次后再进行再生，对于纯化不同的GST标签蛋白，需要按照以下步骤对填料进行再生处理

①使用5倍填料体积的0.1M Tris-HCl，0.5M NaCl， 0.1% SDS，pH8.5进行清洗

②使用5倍填料体积的0.1M 醋酸盐，0.5M NaCl， 0.1% SDS， pH4.5进行清洗

③使用5倍填料体积的纯化水进行清洗

④使用5倍填料体积的PBS进行清洗

⑤加入20%乙醇溶液，保存与4 ℃

FAQ：

1）.GST标签重组蛋白不能与填料结合

①GST标签未能正确表达→对质粒进行测序确认；使用anti-GST抗体进行Western Blotting鉴定

② GST标签重组蛋白在超声波破碎时发生变性→使用温和的破菌条件，减少功率或使用酶解方式

③使用的平衡/洗杂Buffer不合适→检查溶液的组分及pH，当pH低于6.5或高于8.0时，GST标签蛋白不能与填料结合

④样品中加入了高浓度的还原剂，如DTT→降低还原剂的加入浓度或不加入还原剂

⑤上样的流速过快→对于结合能力弱的GST标签蛋白，降低上样流速

2）.纯化产物含有很多杂蛋白

① GST标签重组蛋白在超声波破碎时发生变性→使用温和的破菌条件，减少功率或使用酶解方式

② 层析填料使用过量，产生了较多的非特异性吸附→减少填料的使用量

③ GST标签重组蛋白发生了降解→在破菌时加入蛋白酶抑制剂或使用蛋白酶缺失的菌株表达蛋白

④ GST标签重组蛋白与杂蛋白产生了结合→提高洗杂Buffer的盐浓度，或加入1%的TritonX-100或在平衡液中加入5mM DTT

3）.GST标签蛋白不能被洗脱液洗脱下来

① 洗脱液的GSH浓度偏低→增加洗脱液中的GSH浓度，最多可增至60mM

② 洗脱液的pH偏低→检查洗脱液的pH，或者将洗脱液的pH增加至9.0进行洗脱

③ 洗脱液的盐浓度偏低→可以适当增加NaCl的浓度，也可尝试在洗脱液中加入0.1% TritonX-100

④ 洗脱液中的GSH被氧化→使用新鲜配制的洗脱液

⑤ GST标签重组蛋白发生了降解→在破菌和洗杂时加入蛋白酶抑制剂或使用蛋白酶缺失的菌株表达蛋白

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