亲和素、链酶亲和素、中性亲和素的纯化

原理：利用层析填料上的生物素(Biotin)或亚氨基生物素( Iminobiotin )可以与亲和素、链酶亲和素、中性亲和素以及他们的衍生物特异性结合的性质，将这些物质从含有杂蛋白/杂质的溶液中分离出来。

★一般来说，配基为生物素(Biotin) 填料与亲和素、链酶亲和素、中性亲和素结合非常牢固，只有将这些物质变性后才能从填料上洗脱下来。配基为亚氨基生物素( Iminobiotin ) 填料与亲和素、链酶亲和素、中性亲和素结合相对较弱，不需要对它们变性即可洗脱。

生物素填料(Immobilized Biotin Resin)：

生物素填料一般用来做Pull-Down实验

需要用到的Buffer：

结合/洗杂Buffer：1×PBS

洗脱Buffer：0.1M 甘氨酸，pH2.8

中和Buffer：1M Tris，pH8.5

实验步骤：

1.将含抗原的样品与亲和素/链酶亲和素/中性亲和素标记的抗体进行混合孵育，室温孵育30min或4 ℃过夜孵育

2.使用结合Buffer对填料进行平衡

3.将填料加入步骤1的混合液中室温或4 ℃一起孵育1h

4.将步骤3的混合液放入离心机中离心，收集填料

5.使用洗杂Buffer对填料进行清洗，可以使用2倍填料体积的洗杂Buffer清洗填料5次以上

6.使用和填料相等体积的洗脱Buffer进行洗脱，收集洗脱液并立即加入1/10被洗脱液体积的中和Buffer。再重复该洗脱步骤2~3次并分别收集洗脱液用于后续检测。

7.使用结合Buffer再次平衡填料，加入终浓度为0.02%的叠氮化钠，放于4 ℃进行保存

亚氨基生物素填料(ImmobilizedIminobiotinResin)：

亚氨基生物素可以亲和素、链酶亲和素或中性亲和素在pH>9.5的条件下进行结合，并且在PH<4.0的条件下进行解离。因此可以用来纯化亲和素、链酶亲和素或中性亲和素或它们标记的蛋白

需要用到的Buffer：

结合/洗杂Buffer：50mM碳酸铵，0.5M NaCl，pH 11.0

洗脱Buffer： 50mM醋酸铵，0.5M NaCl，pH 4.0

实验步骤：

1. 将填料装与层析柱中，使用结合Buffer对填料进行平衡

2.将样品进行上样，上样流速不要太快

3.上样完成后使用洗杂Buffer对填料进行洗杂，洗杂体积应大于5倍填料体积

4.洗脱Buffer对填料进行洗脱，分管收集洗脱液，用于后续检测

5.使用结合Buffer再次平衡填料，加入终浓度为0.02%的叠氮化钠，放于4 ℃进行保存

FAQ：

1.做Pull down实验时，未能获得目标蛋白

①亲和素/链酶亲和素/中性亲和素标记的抗体失活→优化标记抗体的条件，防止抗体在标记过程中失活

2.在纯化亲和素、链酶亲和素或中性亲和素标记的蛋白时未能洗脱出目标蛋白

①结合在亚氨基生物素填料上的蛋白未能被洗脱下来→降低洗脱液的pH或增加洗脱液的盐浓度

3.在纯化亲和素、链酶亲和素或中性亲和素标记的蛋白时洗脱的蛋白含有杂蛋白

①杂蛋白与填料发生非特异性结合→增加洗杂Buffer体积或在洗杂Buffer中加入0.1%的Tween20或其他非离子型去污剂

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