近年来，抗生素的滥用引发大量耐药菌株产生、抗生素疗效下降等一系列问题，严重威胁着人类和动物的健康。作为抗生素的一类可能替代物，抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)具有广谱抗菌活性，对部分病毒、寄生虫、肿瘤细胞等也具有抑杀作用，且不易产生耐药性，在医学、兽医学和生命科学等研究领域有着良好的应用前景。

抗菌肽的理化性质及分类

抗菌肽是一类有生物学活性的小分子多肽，分子量一般小于10kD，通常是由12~60个氨基酸组成。富含赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸，并且含有高于30%的疏水性氨基酸。抗菌肽大多为两亲性且带有一定量的正电荷，带+2~+9，为阳离子多肽。

根据NMR测定的三维结构可以把抗菌肽肽分为5大类：（1） α螺旋结构的抗菌肽，有许多的结构和生化研究都集中在蛾血素上；（2）富含半胱氨酸的抗菌肽，比如人类中性粒细胞肽HNP-1 , HNP-2和HNP-3；（3）β折叠结构的抗菌肽；（4）富含组蛋白、精氨酸和脯氨酸的抗菌肽；（5）含有稀有的氨基酸和修饰过的抗菌肽。

抗菌肽作为宿主防御肽，几乎存在于所有生物体内。目前，从哺乳动物、两栖动物、海洋动物、昆虫、植物和微生物等生物体内已发现3000多种抗菌肽，其中约76.11%来源于动物。

目前抗菌肽的制备

目前获得抗菌肽的方式主要有以下几种：(1)从生物体内直接分离提纯有生物活性的抗菌肽。这种方法比较繁琐，且得到的抗菌肽含量普遍很低，不适合进行规模化生产，仅适合进行技术开发；(2) 人工合成抗菌肽，根据已知的抗菌肽基因序列，用化学的方法合成抗菌肽。但这种方法成本高、价格贵，不适于广泛普及应用。(3) 酶解法，主要是通过将有抗菌活性的蛋白用特定的蛋白酶切割下其有抗菌活性的部分进行纯化，继而得到抗菌肽。这种方法得到的抗菌肽活性较高，但是纯化比较麻烦，产量低，需要的成本也较高。三种方法制约了规模化生产。

基金因工程菌生产的抗菌肽及其制备难点

相比于传统的分离法和化学合成法，采用基因工程技术是开发、生产抗菌肽的有效方法。一方面，经过基因工程技术得到的抗菌肽，可以作为产品进行鉴定和开发；另一方面，与其他的方法相比，基因工程法存在着可以大规模生产、成本低等潜在优势。

3.1大肠杆菌生产抗菌肽

（1）大肠杆菌表达系统生产抗菌肽

大肠杆菌表达系统是应用最早的表达系统，对其的研究也就更为深入，在所有基因工程菌生产抗菌肽的方法中大肠杆菌表达系统是最常见的。清晰的遗传学背景、成熟的表达技术以及菌体生长快等特点使其得到了广泛的应用。例如，复合抗菌肽 AL32-P113 和重组抗菌肽 UBI 18-35 实现了在大肠杆菌中的表达，并得到了可观的表达量 12.1 mg/L 和 6 mg/L。但其他抗菌肽也有一定的开发空间，如 Fowlicidin-3在大肠杆菌 BL21 Rosetta 中的融合表达，得到了表达量为 0.84 mg/mL 和 0.71 mg/mL 的抗菌肽Trx-Fowlicidin-3a 和 Trx-Fowlicidin-3b。目前，用大肠杆菌来生产抗菌肽的方法已经十分的成熟，并取得了广泛的应用，是抗菌肽规模化生产的一条有效途径。

（2）大肠杆菌表达系统生产抗菌肽的困难因素

影响大肠杆菌表达系统生产抗菌肽的因素：① 大肠杆菌表达系统由于没有像真核生物一样后期的翻译即修饰蛋白的能力，导致了中间产物的过度累积，容易形成包涵体结构。缺点就是目标肽在包涵体构成过程一般是不可直接控制的，而有效控制的方法是在融合表达过程中有望进行包涵体的表达。由于后期的翻译能力弱，也使得分泌的抗菌肽的稳定性较弱，活性弱。② 容易产生内毒素，这会导致抗菌肽在后期表达过程中容易对宿主造成“自杀现象”，即杀灭本身的宿主菌。③ 表达载体的选择。不同类型的表达载体也会对抗菌肽的生产产生不同的影响

3.2酵母菌生产抗菌肽

（1）酵母表达系统生产抗菌肽

毕赤酵母是酵母表达系统中应用最为广泛的表达系统，但由于没有稳定的附加体质粒，在表达外源抗菌肽基因时，所用的表达载体几乎都是可以直接整合到酵母基因组中的整合型质粒载体，如 pPICZ 和 pIPC3k 等。表达系统中用于生产抗菌肽的宿主菌株都是通过原野生型菌株 NRRL-Y11430 经过改良得到的。多种抗菌肽实现了在酵母菌中的表达，而且得到了可观的表达量。抗菌肽 Moricin 的基因经扩增后导入毕赤酵母，实现了高表达，经发酵在上清液中得到 248.98 mg/L 的重组蛋白，经检测有明显的抑菌活性。重组表达载体 pPICZαA-GST-Apidaecin 在毕赤酵母菌中实现表达，成功表达出有明显抗菌活性的 Apidaecin型抗菌肽，表达量为 1.76 g/L。

以上研究表明，通过毕赤酵母菌生产抗菌肽是一种有效的生产方法，而且相对于大肠杆菌，作为真核表达系统的毕赤酵母具有更多的优势。

（2）毕赤酵母表达系统生产抗菌肽的困难因素

外源抗菌肽基因在毕赤酵母中表达时，有很多的因素都会影响抗菌肽的生产。① 外源抗菌肽基因自身的内在因素。选用毕赤酵母偏爱的密码子可以在一定程度上提高抗菌肽的表达效率。②mRNA 5′端非翻译区的组成长度与 AOX1/MOX 保持一致也可以提高抗菌肽产量。③ UTR 序列、A+T含量和基因的拷贝数等都会在一定程度上限制抗菌肽的生产量。④毕赤酵母自身分泌蛋白酶，对外源抗菌肽有一定的溶解作用，这是其面临的主要问题。

3.3枯草芽胞杆菌生产抗菌肽

（1）枯草芽胞杆菌表达系统生产抗菌肽

枯草芽孢杆菌是遗传和生理水平最好的革兰氏阳性菌之一。其染色体的整个序列是已知的，这极大地加快了基因工程技术的应用进程。经过多年努力，芽孢杆菌表达系统已经克隆和表达了多种真核和原核的外源基因。有研究者成功构建表达载体 pMK-BD-2/CP1，并实现了融合抗菌肽 pBD-2/cecropin P1 在枯草芽孢杆菌中的表达，表达量为 45 mg/L，经验证有良好的抗菌活性。通过人工合成抗菌肽的目的基因序列，将其与表达载体 pHT43 进行连接，构建重组表达质粒 pHT43/SS-BD和 pHT43/CC34，转入到枯草芽孢杆菌中，成功表达出有抑菌效果的抗菌肽 β-defensi 和 CC31。除此之外，抗菌肽阴极诱导素-BF和抗菌肽Abaecin也实现了在枯草芽孢杆菌中的表达，表达量分别为 0.5 mg/L 和 3 mg/L。以上研究表明，枯草芽孢杆菌作为基因工程菌也为抗菌肽的生产提供了一条良好的途径。

（2）枯草芽胞杆菌表达系统生产抗菌肽的困难因素

枯草芽胞杆菌表达系统在抗菌肽的生产中主要有以下几点限制因素：①枯草芽孢杆菌本身分泌蛋白酶，会降解一部分分泌表达的抗菌肽而影响表达量。②不能高效的表达，抗菌肽的表达效率低，这也是其亟待解决的问题。③ 质粒的不稳定性表现在两方面，即结构的不稳定性和分离的不稳定性。前者容易引起抗菌肽基因片段的丢失和结构的改变，后者容易导致表达载体质粒的丢失。使用整合性质粒是解决质粒不稳定性的一条有效途径。

3.4乳酸菌生产抗菌肽

（1）乳酸菌表达系统生产抗菌肽

乳酸菌是一种益生菌，本身就可以产生抗菌和杀菌物质，不产生内毒素，表达的抗菌肽和菌体可以一起用来饲喂动物，经过改造的乳酸菌几乎不分泌本源蛋白，也就间接降低了抗菌肽被内部分解的风险。因此它与其他表达系统相比存在一些天然优势。有研究表明，已有抗菌肽在乳酸菌中实现成功表达，有研究者成功实现了抗菌肽 Baetenecin7 在乳酸菌中的表达，得到了具有生物活性的抗菌肽 Baetenecin7。还有研究者成功实现了人源抗菌肽LL-37在乳酸菌NZ9000中的表达。这表明了乳酸菌表达系统作为一种新型表达系统，也有着生产抗菌肽的潜能。也可以作为抗菌肽开发以及规模化生产的途径。

（2）乳酸菌表达系统生产抗菌肽的困难因素

乳酸菌表达系统作为生产抗菌肽的新兴系统，已慢慢被人们所熟知以及应用，但也存在一些问题与不足。首先就是乳酸菌作为表达系统在表达抗菌肽方面的研究报道较少，目前对乳酸菌表达系统的研究还处于探索阶段，对其遗传背景的认识还很薄弱，这限制了其发展。其次蛋白表达效率低以及信号肽分泌效率的不稳定都是影响抗菌肽生产的重要因素。

4. 基因工程菌生产抗菌肽模式图

为了能更直观地看到抗菌肽在基因工程菌的生产过程，下图为抗菌肽在基因工程菌中生产过程的模式图。

5.总结

在抗生素滥用的大背景下，抗菌肽拥有着众多优点无疑是代替抗生素的最佳选择。利用基因工程发酵生产的抗菌肽目的性强，技术上有提高产量的空间，特别是应用可食用工程菌，成本低、应用广，是生产抗菌肽的一条理想途径。因近年来越来越多抗菌肽分子改造技术以及表达系统的新技术相继被报道，也为抗菌肽的开发带来了更多的选择。相信在不久的将来，抗菌肽势必会有更好的未来，来造福于人类。

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