生物素标记蛋白的纯化

原理：利用层析填料上的亲和素、链酶亲和素可以与生物素(Biotin) 进行特异性结合的性质，将生物素标记的蛋白含有杂蛋白/杂质的溶液中分离出来。

★一般来说，亲和素或链酶亲和素填料 与生物素(Biotin )结合非常牢固，只有将这些物质变性后才能从填料上洗脱下来。

亲和素或链酶亲和素区别

亲和素(Avidin)是分子量约为67kDa，含有四个相同的128个氨基酸亚单位的糖蛋白，其糖含量约占分子量的10%。它的每个亚单位都有一个单一的生物素结合结构域，结合亲和力为 (Ka=1015M‐1 )

链霉亲和素也是一种四聚体蛋白，在许多方面与亲和素相似，只是它不含 糖蛋白，分子量略低，约为60kDa。链霉亲和素相对于亲和素的优点是，碳水化合物的缺乏会显著降低非特异性吸附；其对生物素的结合能力与亲和素相当

★将亲和素或链酶亲和素作为配基偶联至填料上即可用于纯化生物素标记的蛋白

亲和素或链酶亲和素填料应用：

1.使用重力柱纯化生物素标记的分子

所需试剂：

结合/洗杂Buffer：1×PBS

洗脱Buffer：8M盐酸胍，pH 1.5

实验步骤：

1.将亲和素或链酶亲和素填料装入重力柱中，使用大于5倍填料体积的平衡Buffer对填料进行平衡

2.将生物素标记抗体、蛋白或其他分子进行上样过柱，上样流速不必过快

3.使用10倍填料体积以上的洗杂Buffer清洗填料

4.使用5～10倍填料体积的洗脱Buffer对生物素标记的物质进行洗脱，收集洗脱液时可以分管进行收集

★通过此盐酸胍洗脱过后的填料其配基已经变性，因此不能重复使用

2.使用亲和素或链酶亲和素填料制备亲和填料

所需试剂：

生物素标记的抗体、蛋白或其他分子

结合/洗杂Buffer：1×PBS

洗脱Buffer：0.1M甘氨酸，pH 2.8

中和Buffer：1M Tris-HCl，pH8.5

实验步骤：

1.将亲和素或链酶亲和素填料装入重力柱中，使用大于5倍填料体积的平衡Buffer对填料进行平衡

2.将生物素标记抗体、蛋白或其他分子进行上样过柱，上样流速不必过快

3.使用10倍填料体积以上的洗杂Buffer清洗填料，此时亲和填料已制备完成

4.将含有能与生物素标记抗体、蛋白或其他分子产生相互作用物质的样品加入至填料中进行过柱结合，流速不应过快

5.使用10倍填料体积以上的洗杂Buffer清洗填料

6.使用5～10倍填料体积的洗脱Buffer对与生物素标记抗体、蛋白或其他分子产生相互作用物质进行洗脱，收集洗脱液时可以分管进行收集，加入1/10倍洗脱液体积的中和Buffer

7.使用10倍填料体积的平衡Buffer再次平衡填料，加入终浓度为0.02%的叠氮化钠保存与4 ℃即可

3.做免疫沉淀或Pull-Down实验：

所需试剂：

生物素标记的抗体、蛋白或其他分子

结合/洗杂Buffer：1×PBS

洗脱Buffer：0.1M甘氨酸，pH 2.8

中和Buffer：1M Tris-HCl，pH8.5

实验步骤：

1.在1.5或2ml离心管中使用50~100ul的结合Buffer溶解抗原

2.向溶好的抗原中加入生物素标记的抗体或捕获蛋白

3.放于4℃过夜孵育

4.加入适量的亲和素、链酶亲和素填料，在室温或4℃夏震荡孵育1h以上

5.将孵育好的混合液离心，2000×g，2min，弃上清

6.加入1ml的洗杂Buffer重选填料，并离心，弃上清，重复此洗杂步骤4次以上

7.加入0.5~1ml的洗脱Buffer，重选填料，离心，收集上清液，加入1/10倍洗脱液体积的中和Buffer

填料清洗：

随着非特异结合蛋白的增多和蛋白的聚集，会造成流速和结合载量性能下降，此时需对填料进行清洗

1）.去除一些沉淀或变形物质

用2倍柱体积的0.1M NaOH或6M盐酸胍或8M尿素溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH7.4清洗。

2）.去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质

用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH7.4清洗。

FAQ：

1）.洗脱组分中无目的蛋白

①过度的裂解使目的蛋白变性→使用温和的裂解条件，如低温

②目的蛋白聚集产生沉淀→在细胞裂解前溶液中加入DTT，终浓度为1-10 mM

2）.目的蛋白没有完全洗脱下来

①洗脱体积太少→增加洗脱液体积，减小洗脱流速

②洗脱液中盐酸胍的pH 发生改变→使用新鲜配制的洗脱液

③洗脱时孵育时间不够→增加洗脱液与凝胶的孵育时间

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