毕赤酵母电转感受态细胞制备及电转化：

一，实验试剂及仪器：

试剂：

40%葡萄糖：40g葡萄糖加入溶解并定容至100mL，115 ℃高压灭菌30min，4 ℃保存。

0.02%生物素：20mg生物素加水溶解定容至100mL，用0.22um滤器过滤除菌，4 ℃保存。

1M山梨醇：18.3g山梨醇加水溶解并定容至100mL，121℃灭菌20min

YPD华体会体育最新地址 ：酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，加水溶解定容至950mL，121℃灭菌20min，冷却后加入50mL的40%葡萄糖。

YPDS固体华体会体育最新地址 ：酵母提取物1g，胰蛋白胨2g，18.3g山梨醇，2g琼脂粉，加水溶解定容至95mL，121℃灭菌20min，冷却至~60℃后加入5mL的40%葡萄糖，混匀后倒培养皿中，每个培养皿倒~15mL即可。(如需加抗生素可在华体会体育最新地址 冷却至40℃左右加入，然后再倒至培养皿中)。

RDB固体华体会体育最新地址 ：1.34gYNB，18.3g山梨醇，2g琼脂粉，加水溶解定容至95mL，121℃灭菌20min，冷却至~60℃后加入5mL的40%葡萄糖和0.2mL的0.02%生物素，混匀后倒培养皿中，每个培养皿倒~15ml即可。

仪器：

离心机；电转仪；电转杯；全温震荡培养箱

二，实验步骤：

感受态细胞的制备：

①取0.2mL毕赤酵母菌种接种于4mL的YPD试管中，30 ℃，200rpm过夜培养（16-18h）

②从试管中取0.25mL菌液，接种含250mL YPD华体会体育最新地址 的2L摇瓶，过夜培养至OD600＝1.3-1.5

③4℃，3000rpm离心5min收集细胞，弃上清，用200mL预冷的灭菌水悬浮细胞

④再次4℃，3000rpm离心5min收集细胞，弃上清，用200mL预冷的灭菌水悬浮细胞

⑤4 ℃，3000rpm离心5min收集细胞，弃上清，用20mL预冷的1M山梨醇悬浮细胞

⑥再次4 ℃，3000rpm离心5min收集细胞，弃上清，用20mL预冷的1M山梨醇悬浮细胞

⑦4 ℃，3000rpm离心5min收集细胞，弃上清，用0.5mL预冷的1M山梨醇悬浮，即为感受态细胞；将感受态细胞分装80uL/管，-80℃保存

电转化：

①电转杯以及杯盖在紫外灯下照射过夜，第二天将其取出放置于-20℃冰箱预冷

②20uL灭菌水溶解20ug的质粒，取10uL溶解后的质粒加入至80uL感受态细胞中，轻轻吹打混合，转入预冷的0.2cm电击杯中，冰上放置5min；

③按照1.5kV, 25µF,200Ω参数进行电击（如果使用0.1cm 电转杯，需将电击参数修改为：0.75kV， 25µF，200Ω）

④电击后立即加入1mL 预冷的1M山梨醇至电击杯中，用移液枪轻轻吹打混匀，将其转移至1.5mL灭菌离心管中，放置30 ℃培养箱中静置

⑤涂板：

如表达载体为pPIC9K，pPIC3.5K，30℃静置1h后，室温，3000rpm离心5 min后，吸去上清液并留200uL培养液重悬菌体，涂布RDB固体培养皿中

如表达载体为pPICZa和pPICZ系列载体， 30℃静置1h后，室温，3000rpm离心5min后，吸去上清液并留200uL培养液重悬菌体，涂布含Zeocin (100ug/mL) 的YPDS固体培养皿中

⑥平板于30℃电热培养箱中培养30min后倒置，孵育3-4天待转化菌落出现。

判定标准：①转化平板无明显霉菌或其他杂菌污染，②有多个单克隆菌落，③克隆形态为乳白色，边缘光滑。

如过发现无克隆或克隆数过少，则可能被污染或未转化成果，则需要重新转化。