虽然已有数百种外源蛋白在毕赤酵母中表达成功， 但不同外源蛋白的表达量却差异巨大。HASSLACHER M 等报道过的用毕赤酵母发酵生产胞内羟基腈裂解酶，表达量可达22 g/L，而WEISSS等用毕赤酵母表达仓鼠阮病毒蛋白质PrPc的表达量却不足0.1 mg/L。因此，研究不同蛋 白在毕赤酵母表达系统中的表达机制及发酵条件具有重要意义。

典型的毕赤酵母高密度发酵过程通常由细胞生 长期(甘油分批培养/ 流加培养)和甲醇诱导期(甲醇 诱导)两个阶段组成。其中,细胞生长期的目的是获取高密度且功能健全的细胞 ,此阶段面临的主要难题是氧气不足、甘油流加过量导致乙醇积累。另一方面,甲醇诱导阶段的主要目的 是采用合理的甲醇诱导控制策略使目的蛋白的产量、 活性或效价最大化,但在此诱导阶段在通空气供氧条件下,毕赤酵母细胞的高耗氧特性导致甲醇浓度和溶解氧(dissolved oxygen,DO)浓度相互影响和耦联,无法同时得到控制。

1、碳源选择

菌体生物量的积累是提高外源蛋白表达量的关键。当生长阶段华体会体育最新地址 中碳源耗尽时可以通过流加补料方式补充甘油，使菌体再次生长到达更高生物量水平。这个阶段的补料碳源、补料速率、流加方式及时间等都是细胞增殖效率的影响因素。常用补料方式包括3种：间歇性流加补料、恒速流加补料以及指数流加补料。间歇性流加和恒速流加方式较为普遍，且操作简单，但往往不能很好的满足菌体生长需要。指数流加是根据菌体生长规律而建立的补料方式，这种方式能较好的保持补料速率与菌体需求的一致性，但对菌体生长速率的把握有一定难度。

用于细胞培养期的改良型 DO-Stat 甘油流加策略,该策略能够在保证 细胞快速生长的同时避免代谢副产物乙醇积累对细胞的毒害。

甲醇诱导阶段策略:“甲醇浓度受限-溶氧浓度充足”(甲醇浓度 ~ 0 g / L, DO ~10% )和“甲醇浓度充足-溶氧浓度受限” (甲醇浓度 5-10 g / L,DO ~ 0% ) 。

3 流加策略3

毕赤酵母表达系统自20世纪80年代发展至今，在外源 蛋白表达方面显现出了独特优势，因而受到越来越多的关注。但由于外源蛋白的特异性，不同蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达量差异显著，极大地限制了工业化生产。由于现阶段毕赤酵母表达系统的分子生物学研究已比较透彻，因此，在表达系统构建成功的基础上，进一步优化发酵培养条件是提高外源蛋白表达量的有效手段。在发酵过程中，发酵条件的选择、工艺参数的确定以及诱导机制的建立都与外源蛋白的表达量有着密切关系。众多的研究结果表明，不同外源蛋白因分子量等性质的不同、结构的差异等，其发酵工艺参数与蛋白表达量的关系也不同， 因此，根据表达蛋白自身性质的不同而建立相应发酵工 艺体系对于深入研究外源蛋白性质与表达机制的关系有重要意义，也为探索新型外源蛋白在毕赤酵母中的表达提供指导。目前，很多实验室规模的外源蛋白的过程控制和优化技术已经取得了较好的成果，但放大到工业化规模生产上却受到种种限制。因此，深入研究发酵控制策略在中试生产中的应用将是未来毕赤酵母工艺优化的重要发展方向。