体外重组蛋白表达技术已经渗透到生物学的各个领域。目前，体外重组蛋白表达系统主要有四类：原核表达系统、哺乳动物细胞表达、酵母表达系统及昆虫细胞表达。表达的一般实验包括载体构建-表达鉴定-蛋白纯化三大步骤。在构建载体阶段，除了一些必要的表达元件，还需要考虑的密码子优化和标签的选择。选择合适的标签不但有利于蛋白的纯化，促进蛋白的可溶性，同时也不能影响蛋白的结构功能和下游应用。本文详细介绍了几种蛋白纯化标签，帮助我们更好的设计实验。

融合标签	大小（KD）	供能	是否切除
HIS	0.84	有利纯化，能纯化可溶性/包涵体蛋白	标签小，无影响
GST	26	增强可溶性，仅能纯化可溶蛋白，屏蔽毒性蛋白	标签大，影响较大
MBP	44.4	增强可溶性，屏蔽毒性蛋白	标签大，影响较大
NusA	55	增强可溶性，屏蔽毒性蛋白	标签大，影响较大
SUMO	11.2	增强可溶性，屏蔽毒性蛋白	标签大，有影响

固定化金属离子亲合层析（Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC），也称金属螯合亲合层析，是一种新型的原核蛋白纯化的技术。该方法通过蛋白质表面的一些特殊的氨基酸，使之与金属离子发生相互作用，从而对蛋白质进行亲和纯化。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合等，其中以6个组氨酸残基组合的融合标签（His-Tag）应用最为显著。His-Tag可结合在目的蛋白的C末端或N末端，形成特殊的结构，以便于进行下一步的纯化及检测。由于金属螯合亲合层析具有配体简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，可选择范围广。在高盐分、存在变性剂以及去垢剂的上样条件下也能进行纯化。

His-tag 作为重组蛋白纯化时的首选标签，其优势在于：N-端的His-Tag与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达；采用IMAC（固定化金属离子亲合层析）纯化His-Tag融合蛋白操作更加简便；His-Tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响，不会改变目的蛋白本身的可溶性和生物学功能；His-Tag非常小，在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响；His-Tag的免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体；与其它亲和标签构建成双亲和标签，并可应用于多种表达系统；His-Tag融合蛋白的适用范围也较广，既可以在非离子型表面活性剂存在的条件下纯化，也可以在变性条件下进行纯化。前者通常用来纯化疏水性强的目的蛋白，而后者则通常纯化包涵体蛋白。

His-Tag 亲和层析填料：His-Tag可与多种金属离子发生特殊的相互作用，如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+，Fe3+等，其中Ni2+在亲和纯化实验中的使用最为广泛。根据结合基团的不同，Ni2+亲和层析柱可分为俩类----Ni-IDA 和Ni-NTA。Ni2+有六个螯合价位，其中Ni-IDA螯合了三价，Ni-NTA螯合了四价。所以IDA的载量要比NTA的高，在同样条件下Ni-IDA洗脱时的咪唑浓度也高于Ni-NTA。但其弱的结合力使金属离子在洗脱阶段时很容易浸出，与目的蛋白紧密结合，从而导致分离蛋白产量偏低，产品不纯及金属离子污染等问题。而NTA的颗粒粒度均匀，粒径更小，并且螯合镍更稳定，能耐受较高的还原剂，使填料更加稳定，镍离子不易脱落。

IMAC在通常的情况下是比较稳定的，但螯合剂的存在则会导致其金属离子脱落。例如在E.coli的裂解液中普遍存在一些非特异的弱螯合剂，如在三羧酸循环中产生的二羧酸类物质。因此，E.coli在某些高压情况下就会产生高特异性的金属螯合剂（通常存在于细菌的细胞周质中），导致His-Tag融合蛋白纯化的纯度和产量大大降低。所以在进行纯化His-Tag融合蛋白的实验时，首先需要去除螯合剂。

1. Ni-NTA装柱，1.6×20cm，柱床体积为10mL；
2. 用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2mL/min；
3. 将20mL细胞破碎液（50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl）0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1mL/min；
4. 用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2mL/min；
5. 用分别含10、20、50、100、200、300、400mM 咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2mL/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；
6. 用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2mL/min，柱子置于低温环境中保存。

缓冲液1：50mM pH7.4的PBS缓冲液。配制：0.5M NaH2PO4 19mL，0.5M Na2HPO4 81mL，NaCl 29.3g，加适量水溶解后定容到1000mL。

缓冲液2：50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS 溶液。配制：0.5M NaH2PO4 19mL，0.5M Na2HPO4 81mL，NaCl 29.3g和咪唑34g, 加适量水，调pH后定容到1000mL。

缓冲液3：不同咪唑浓度的缓冲液B配制：

咪唑浓度（mM）	缓冲液1用量（mL）	缓冲液2用量（mL）
10	98	2
50	90	10
100	80	20
200	60	40
300	40	60
400	20	80

咪唑洗脱原理：Ni柱中的氯化镍可以与有His-Tag的融合蛋白结合，也可以与咪唑进行结合，当标签蛋白与层析柱表面珠孔内的镍离子介质发生结合时，不同浓度的咪唑通过层析柱，就会将与镍配位的标签蛋白，杂蛋白等分别洗脱下来，从而得到高纯度目标蛋白。

GST-Tag相对分子质量较大，约为26KD，插入在目的蛋白的C末端或N末端，大肠杆菌中常用在N端。GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶。一般选择GST标签的目的有两个，一是提高蛋白表达的可溶性，二是提高蛋白的表达量。蛋白表达纯化结束后需根据不同的蛋白应用而确定是否切除标签，切除与否需根据下游应用考虑。如果要去除GST 融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。检测方法可用GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。GST的序列如下：

GST-Tag的优缺点：增加外源蛋白的可溶性；可在不同的宿主中表达，适用范围广；可用不同的蛋白酶可以方便去除；很好保留了蛋白的抗原性和生物活性，提高外原蛋白的稳定性；高特异性，纯化方便且温和；分子量较大，可能会影响蛋白质的功能和下游实验；如果蛋白不可溶，很难用变性的方法纯化。

GST亲和纯化原理：GST亲和层析是利用GST融合蛋白与固定的谷胱甘肽(GSH)通过硫键共价亲和，通过GSH交换洗脱的原理来进行纯化。该纯化柱中，凝胶手臂上通过硫键结合一个谷胱甘肽。然后利用谷胱甘肽与谷胱甘肽巯基转移酶（即GST-tag（26KDa）之间酶和底物的特异性作用力，使得带GST标签的融合蛋白能够与凝胶上的手臂谷胱甘肽结合，从而将带标签的蛋白与其他蛋白分离开。谷胱甘肽通常有氧化型GSSG和还原型GSH，当我们使用GSH洗脱时，GSH会与凝胶上的谷胱甘肽竞争结合融合蛋白，从而将目标蛋白洗脱。GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶（Glutathione sepharose）亲和树脂进行纯化。GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如：盐酸胍或尿素等。如果蛋白表达在包涵体中，可复性后再纯化。此外要去除GST标签，可用位点特异性蛋白酶切除。GST蛋白纯化流程图如下：

MBP（麦芽糖结合蛋白maltose binding protein），残基数346，分子量42.5KDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码，构建时刻放在N端，用来提高可溶性（尤其是真核蛋白）。MBP的折叠需要DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GeoES两个分子伴侣系统的帮助，这可以使这些分子伴侣聚集到目的蛋白的附近帮助其正确折叠。另外，以标签蛋白形式存在的麦芽糖结合蛋白可以减少目的蛋白的降解，提高表达产物的水溶性，也为以后对目的蛋白的纯化提供了基础。麦芽糖结合蛋白能够被多糖树脂吸附，因此在过柱时，能够使融合蛋白与其它蛋白成份分离。

MBP标签的优缺点：简单亲和纯化即可实现；增加蛋白表达量和蛋白稳定性；促进蛋白的可溶性和正确折叠；标签较大，对蛋白的结构/功能会有一定影响。

NusA是大肠杆菌自身的一种蛋白，即转录抗终止因子，残基数495，分子量:54.8KDa，由1999 年Davia将NusA从4000种大肠杆菌蛋白库中筛得。NusA不具有独立的纯化标签功能，所以要与其它标签(如His标签)联用。利用原核表达时，NusA标签可以明显的提高蛋白的可溶性，例如含有NusA标签的人白介素-3融合蛋白(NusA/hIL-3)在37℃条件下诱导表达几乎全部可溶(97%)，而当其单独表达或融合GST标签表达时都是包涵体形式。另外NusA标签还可以提高不溶性靶蛋白如牛生长激素（bGH)、人干扰素-γ(hIFN-γ)的可溶性。来自草木犀根瘤菌(Rizobiummeliloti)的酪氨酸激酶因为分子量大(超过54kDa)并且基因含有大量稀有密码子，自身在大肠杆菌中无法过量表达，但是与NusA融合后却可以高效表达。

NusA的优缺点：可以提高蛋白质的溶解性，可选的标签有NusA，MBP，GST；这些标签不能用专门的亲和基质纯化，融合蛋白构建时必须与可用于纯化的小亲和标签连用。尤其是当NusA蛋白增加融合蛋白溶解性时，一些在大肠杆菌中表达为不溶性的蛋白在与NusA在N端融合时则变成可溶。但是由于它的分子量较大，导致靶蛋白的得率相对降低；NusA本身不具有独立的纯化标签功能，所以要与其它标签如His 标签联用；NusA对蛋白下游应用会有影响，如蛋白需进行结构分析（晶体衍射或核磁共振）。

SUMO标签蛋白是一种小分子泛素相关修饰蛋白，是存在于真核生物中高度保守的参与蛋白质小泛素化相关修饰的一类大蛋白。与GST、MBP或NusA相比，SUMO不仅可以作为重组蛋白表达的融合标签还具备分子伴侣的功能，能促进蛋白的正确折叠，对热和蛋白酶具有耐受性，更有助于保持目的蛋白的稳定性。此外，SUMO 标签有着与其配套的蛋白酶（专一性强），此蛋白酶识别的是SUMO的三级结构，切割的特异性极高，不存在任何氨基酸的残留，因此适用于重组蛋白表达。

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