当细胞密度达到80%~90%时，去掉完全华体会体育最新地址 ，用1X PBS清洗2次。加入胰蛋白酶进行消化，放入细胞培养箱中约2-3min。加入DMEM完全华体会体育最新地址 终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再加入DMEM完全华体会体育最新地址 清洗，弃上清液。加入lml冻存液（90%胎牛血清，10% DMSO。

一般来讲血清含量可以在10%-90%之间调整，冻存液中加入血清一方面可以为细胞提供营养，另一方面可以在细胞冻存过程中提供非渗透性保护物质，如蔗糖，白蛋白等从而更好地保护细胞），放入冻存管内（管内有异丙醇，以保证温度降低的速度），立即放入4oC冰箱中冻存30min，然后放入-20oC冰箱中冻存30min，再置于-80℃冰箱内过夜。

第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放入液氮，可以保存三个月。

细胞冻存和复苏的原则是：慢冻速融，这样更加有利于保持细胞的活力。冻存细胞不加任何保护剂，会导致细胞内冰晶的产生，从而使细胞产生内源性的机械损伤，引起细胞内环境渗透压，PH，电解质等的改变，进而促使细胞死亡。

（1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热；

（2）用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手；

（3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且减少污染；

（4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小；

（5）严格的无菌操作；

（6）贴壁细胞消化适度：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化；

（7）传代细胞所有的操作尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作，每种细胞使用一套器材。避免交叉感染；

（8）传代细胞瓶口每次打开或者关闭都需要在酒精灯上消毒。

最后，大家在进行细胞培养的时候肯定离不开细胞计数仪，给大家推荐一款真正使用切性价比高的细胞计数仪，TANK-Bio细胞计数仪，它是根据经典的台盼蓝染料排除法结合先进的光学成像技术以及图像识别技术研发的。具体可看下图介绍。