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利用遗传学手段，以大肠杆菌作为模式生物来挖掘表型背后存在的机制，不可避免地会接触到大肠杆菌Red同源重组技术。利用同源重组技术可以摆脱限制性内切酶的酶切位点限制, 而且可以方便有效地对复杂、较大的 DNA 片段进行改造和构建。今天我们带领大家来了解一下这其中涉及到的原理。

技术渊源

在大肠杆菌Red同源重组技术开发出来以前，利用PCR fragments flanked by DNA homologous to chromosome-mediated gene replacement（与染色体介导的基因置换同源的DNA侧翼PCR片段）来定向打断染色体基因的方法就已经在酵母和沙门氏杆菌中实现了。然而，在大肠杆菌中线性DNA fragments 很难转化成功，这是由于大肠杆菌含有RecBCD enzymes（去氧核糖核酸外切酶）。RecBCD enzymes是细菌内源性重组系统的重要组成元件，既可以能够通过同源重组修复double-stranded DNA breaks（双链DNA断裂），又可以降解线性dsDNA。因此，想要在大肠杆菌中实现外源线性dsDNA与染色体靶标序列的同源重组，就必须抑制细菌内源性的同源重组系统对线性dsDNA的降解能力。

实际操作

在2000年，有学者研发出一种利用λ噬菌体同源重组系统在大肠杆菌细胞中实现外源线性dsDNA与染色体DNA同源序列之间发生重组的简单高效方法-The phage lambda-derived Red recombination system（非甲基化λ噬菌体Red同源重组系统）。Red同源重组技术的原理是将一段携带与靶基因两翼各有40~60 bp同源序列的PCR片段导入宿主菌细胞，利用λ噬菌体Red重组酶的作用，使导入细胞的线性DNA片段与染色体(或载体)的特定靶序列进行同源重组，靶基因被标记基因置换下来（如图1所示）

PCR引物

PCR引物由两部分组成，靠近5’端的区域为与靶基因同源的序列(约40bp)，靠近3端的区域(约20 bp)与模板DNA互补。这种重组技术是最近发展起来的一项可在染色体水平上进行遗传操作的新技术，只需较短的同源序列, 而不需要特定的限制性酶切位点，即可在生物体内完成重组过程，省去了体外DNA酶切﹑连接等步骤。这样，在靶基因两翼序列已知的条件下就可以通过Red重组技术对该基因进行敲除、敲入、点突变等操作，还可在靶基因的上下游加入适当的启动子和终止子序列以调节基因的表达。将含有ori复制序列的线性载体片段导入细胞，也可将靶基因克隆于载体上。二十年过去后，实验证明，在大肠杆菌中这种基因打靶技术仍是基因功能研究和新菌株构建的有力工具。来自Kirill A.Datsenko撰写的一篇文献中的摘要解释了这一方法的产生与效果：

摘要大致讲述了kirill等人经过研究开发了一种简单高效的方法来破坏大肠杆菌中的染色体基因，其中PCR引物提供了与目标基因的同源性。在此过程中，重组需要噬菌体λ红重组酶，该重组酶是在低拷贝数质粒上由一个可诱导启动子控制合成的。为了证明该方法的有效性，kirill与他的团队使用与该基因相邻区域同源的引物36-50-nt获得了PCR产物，以及携带抗生素抗性基因的模板质粒，该质粒由FRT(FLP识别靶)定位，利用各自的PCR产物，对染色体基因进行了13种不同的突变。将torSTRCAD基因或操作子导入携带合成(PCR)DNA的Ared表达质粒的细菌后，作为耐药菌落分离，再用编码FLP重组酶的辅助质粒消除抗性基因，这一过程应具有广泛的应用价值，特别是在大肠杆菌和其他细菌的基因组分析中，因为该过程可以在野生型细胞中进行。

实际操作要点

在实际的操作中，三种phage lambda-derived Red 蛋白的基因被放置在PKD46载体上。PKD46载体是一个含可以被阿拉伯糖诱导的ParaB promoter（启动子）的低拷贝质粒，对温度敏感，易于消除。当携带PKD46载体的大肠杆菌处于30℃时，加入阿拉伯糖诱导，Gam，Exo，Beta高效表达。一旦外源dsDNA电转进入细胞内时，便可以发生同基因组靶标序列发生同源重组，替换掉要敲除的基因。对于同源重组的顺利发生来说，The phage lambda-derived Red recombination system里面的三个蛋白是非常重要的：

1.Gam蛋白为16kD的多肽分子，可以与RecBCD核酸外切酶和SbcCD核酸内切酶结合，分别形成RecBCD-Gam和SbcCD-Gam复合物，进而抑制RecBCD和SbcCD的活性，从而避免通过电转进入大肠杆菌细胞内的外源线性DNA片段被降解掉。

2.Exo（lambda exonuclease ）是一种核酸外切酶，单亚基的分子量为24kD, 这种蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子，中间有一中空的通道，通道的一端可容纳双链 DNA分子，另一端只可容纳单链DNA。Exo 蛋白可结合在双链DNA的末端，沿着5'-3'方向降解外源dsDNA，这样会在外源dsDNA两端产生一段单链缺口。

3.Beta蛋白是一种退火蛋白,单亚基的分子量为25.8kD。在细胞中,Beta蛋白自发地形成环状结构，紧紧地结合在单链DNA 3’突出端，即由Exo产生的单链缺口处，防止DNA被单链核酸酶降解，促进外源dsDNA片段与基因组靶标位置的同源序列发生退火配对。Beta蛋白在Red同源重组过程中起着决定性的作用,它与沙门氏菌P22噬菌体的 Erf蛋白、大肠杆菌Rac噬菌体的 RecT蛋白、真核生物的Rad52蛋白同属一类重组蛋白家族，都具有介导互补单链DNA退火的功能。

作用机制分析

虽然lambda Red系统被广泛使用，但此系统介导的双链DNA发生重组的详细机制介绍得并不是很清楚。目前有两种主要的观点：如图1，一种认为在大肠杆菌细胞内发生同源重组的过程中产生了一种两端有单链挂钩的dsDNA中间体。如图2，另外一种观点则认为产生一种ssDNA中间体（另外一条链被Exo完全降解掉了）。研究者认为这两种中间可能都存在，但是ssDNA占据主导地位。从这里我们可以看出外源DNA片段是在DNA复制的时候，与染色体发生同源重组来替换掉靶标基因。Lambda Red Recombineering in Escherichia coli Occurs Through a Fully Single-Stranded Intermediate

具体应用

一个好的工具非常重要。大肠杆菌Red同源重组系统，尽管操作上有些繁琐，需要用到三种质粒，但在精确性和成功率上面拥有非常大的优势，具有同源序列短、重组效率高、适用范围广和操作策略灵活的特点，这或许也是如今很多实验室依然在使用这套经典系统的原因。在这套系统基础上，也衍生出很多升级版本，是研究基因结构与功能、表达与调控、转基因及基因治疗等提供有力的工具。
宿主菌的选择：在宿主菌的选择中，实验室常常会使用MG1655/W3110模式的菌株，有时也会使用到DH5-α菌株。在基因工程中，无论是实验室或是工艺生产中，大肠杆菌都是大家习以为常的宿主菌。而大肠杆菌的优势也在基因工程的项目中展示得淋漓尽致，例如：1、 在近五十年的基因工程中，大肠杆菌都是实验室常见的菌种。人们对其细胞形态及生理生化特性已经了解得比较深入，对于华体会体育最新地址 配制与运载体导入的具体技术等方面也更容易把握。2、 细菌质粒是基因工程常用的运载体，大肠杆菌质粒又是细菌质粒中最常用的质粒。因为大肠杆菌质粒上有诸如抗青霉素基因等易于检测的标记基因，且容易使目的基因在宿主细胞中复制和表达。而最适合大肠杆菌质粒完成使命的场所即它的天然来源——大肠杆菌。3、 大肠杆菌是一种典型的兼性厌氧型细菌，由于体积小，相对表面积就较大,并且能利用氧气进行彻底生物氧化释放大量能量，因而能够与外界迅速进行物质和能量交换，并在体内迅速转化。在此条件下，大肠杆菌的新陈代谢极其迅速，就如同一个效率极高的化工厂，但所需反应条件又很温和，容易达到，故大肠杆菌的经济效益很高，是实验室研究和工艺生产中常见的宿主菌。由此可见，大肠杆菌在微生物表达平台中的使用范围之广，意义之重。且有数据支持表示，第一个获得FDA批准上市的基因工程药物是用大肠杆菌表达的——1982年上市的重组人胰岛素，使用大肠杆菌作为宿主菌，有利于FDA认证程序的快速推进，即药物从研发到上市的速度也会更迅速。

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