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前言

代谢工程是指利用基因工程技术对细胞代谢途径进行有目的的修饰与改造,改变细胞特性，生产出特定的目标产物。代谢工程发展至今已有30年的历史，从早期的敲除副产物生成途径、解除产物合成抑制、过表达合成途径中的关键酶等传统改造技术，发展出了代谢反应数据库建立与网络模型计算、代谢途径组装、基因表达动态调控等新的代谢改造技术。
在代谢工程领域内不可忽视的主要菌种就是大肠杆菌。大肠杆菌因研究历史悠久、遗传背景清晰、厌氧生长速度快、能利用简单的无机盐华体会体育最新地址 并可利用多种底物(葡萄糖、木糖、甘油)等特点，成为了一种优秀的工业模式微生物。代谢工程改造大肠杆菌，可用于生产有机醇、氨基酸、有机酸、有机胺、维生素、天然产物及聚羟基脂肪酸酯(Poly hydroxyalk anoates，PHA)等多种产品，并应用于L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、1,3-丙二醇、D-乳酸、丁二酸、戊二胺等大宗化学品的绿色生物合成。基于以上种种优点以及其使用的广泛性，大肠杆菌成为了代谢工程领域内的重要组成部分，并有着非常光明的前景。

接下来菌菌就以大肠杆菌为例和大家一起学习大肠杆菌代谢工程途径设计以及优化相关知识。

大肠杆菌代谢途径设计

设计的大肠杆菌代谢途径依据来源可分为3种：
(1)仅利用大肠杆菌自身代谢途径:如丁二酸、丙酮酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸等代谢产物的合成途径本就存在于天然的大肠杆菌代谢途径中。对大肠杆菌自身的代谢途径进行适当改造与调控，如解除关键位点的反馈抑制、提高限速酶的表达量、调控辅因子代谢平衡等，将代谢流最大程度地引向目标产品。

(2)引入外源代谢途径:大肠杆菌自身拥有的基因有限，常常需要利用外源基因将代谢途径补充完整或提高原有代谢途径的效率。例如在产1,3-丙二醇大肠杆菌细胞工厂中引入了来源于酿酒酵母的甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸酶以及肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶;在L-丙氨酸细胞工厂中引入了来自嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）的丙氨酸脱氢酶;1,4-丁二醇大肠杆菌细胞工厂中则整合了5个不同来源的外源基因。

(3)创建自然界中不存在的代谢途径:在蛋白质理性改造与从头设计等技术的加持下，代谢途径的设计也突破了天然途径的限制,逐步发展出了非天然的合成途径。

大肠杆菌合成途径的创建与优化
DNA片段组装技术

DNA片段组装技术是实现大肠杆菌途径创建的重要前提。传统的DNA片段组装主要依靠限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）和DNA连接酶（DNA Ligase），但这种组装方式有一定的局限性，如接头处会留下酶切位点“疤痕”，需组装的基因片段内部不能存在相应的酶切位点，使可选择的内切酶范围变少。
(1) Golden Gate组装技术:需要使用IIS类限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease Type II），这类酶具有识别和切割双链DNA位置不一致的特性。这种特性使其在识别位点之外切开DNA，产生的粘性末端在连接酶的作用下按照顺序连接,组装成不含酶切位点的DNA片段，实现多个片段的无缝连接。

(2) Gibson组装技术:不需使用限制性内切酶，但各DNA片段末端上互含15-20 bp的同源序列，据此，按照同源序列的顺序进行组装。组装由多个酶协同参与，DNA 5'核酸外切酶（DNA 5' Exonuclease）首先切出一个粘性末端，各粘性末端间根据同源关系互补，再由DNA 聚合酶（DNA polymerase）将缺失的碱基重新复制合成，最后由DNA连接酶连接粘性末端。该方法可以将一个或多个DNA片段按照预定的方向快速﹑高效﹑精确地插入到线性化载体（Linearized vector）中,实现“无缝”组装。

(3) CPEC技术:CPEC(Circular polymeraseextension cloning)是环形聚合酶延伸克隆的简称。其对DNA片段的要求类似于Gibson，末端互含同源序列。CPEC是一种通过 PCR实现DNA片段组装的技术:DNA片段及载体经过变性解链,退火时末端同源序列互补，序列间互为模板和引物在DNA 聚合酶的作用下延伸为含有缺口的环状DNA分子，该缺口可在大肠杆菌中得到修复从而得到完整的质粒。总的来说，CPEC是一种更为简单、高效且经济的DNA组装技术,应用更加广泛,但不适合高GC含量DNA片段的组装。

大肠杆菌基因组编辑技术

在基因组上创建代谢途径，获得遗传性状稳定的大肠杆菌，离不开基因组编辑技术。通过基因编辑，实现外源基因的插入、内源基因敲除以及关键基因的表达调控。同源重组系统是大肠杆菌基因组编辑技术的基础。大肠杆菌中最为常用的系统是Red同源重组系统，它来源于入噬菌体，包括3个蛋白Exo、Beta、Gam，在这3种蛋白的协同下，实现外源片段的同源重组。其同源重组效率较高，同源臂可短至50 bp，操作简单，广泛地应用于大肠杆菌基因编辑中。基于Red同源重组系统（具体可见菌菌先前的文章大肠杆菌Red同源重组原理），结合不同的策略，研究人员开发出了无抗性的基因组编辑技术，常用的有以下3种:
(1)基于FIp重组酶的两步同源重组:Flp重组酶能够识别短翻转酶识别位点序列,并能切除位于两个翻转酶识别位点(Flippase recognition target，FRT)之间的序列。结合Red同源重组系统，先将两端带有FRT序列的抗性基因整合进基因组上的目标位点，再在Flp重组酶的介导下将抗性基因敲除。该技术的缺点是会在目标位点上留下一段FRT序列，并非无痕编辑,在多轮编辑后会影响基因的编辑效率。

(2)基于sacB基因的两步正负筛选法:sacB基因编码分泌性蔗糖果聚糖酶，能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并将果糖合成为高分子量的果聚糖，对大肠杆菌产生致死作用，是一种负筛选标记。在 Red同源重组系统介导下，先将带有抗性基因和 sacB基因的片段整合进目标位点,再将靶片段整合进目标位点，替换掉带有抗性基因和 sacB基因的基因片段,在含有蔗糖的华体会体育最新地址 中培养，通过反向筛选策略，获得替换掉抗性基因和 sacB基因片段的正确转化子。

(3)基于CRISPR/Cas9的一步同源重组:Cas9蛋白在gRNA介导下在靶位点发生剪切，使大肠杆菌基因组双链断裂,产生致死效果。Red同源重组系统可将供体片段整合进靶位点，修复断裂的DNA双链，或是在Cas9蛋白剪切前发生同源重组，使Cas9丢失靶位点而不发生剪切。

基因表达调控技术

基因表达调控是优化代谢途径的重要手段，是代谢工程改造的核心。在大肠杆菌中创建途径之后，需要对关键节点的基因进行表达强度的调控，包括增强产物合成途径和辅因子合成途径，或弱化一些敲除后会导致菌体不生长但对产品生产有不利影响的基因。根据技术层次，分为单基因调控、多基因调控以及基因动态调控技术。

(1)单基因调控:单基因调控是在染色体上对代谢途径某个特定基因的表达进行调控。代谢工程早期，常用强启动子进行单基因调控，如IPTG诱导型Tac启动子、T7启动子等。但对于代谢途径，单基因的强表达可能不是最优方式，会导致代谢负荷。为实现单基因的最优表达，Lu等在大肠杆菌中构建了启动子文库，获得了不同强度的启动子，用于葡萄糖转运蛋白基因galP和葡萄糖激酶基因glk 的调控，组合调控菌株GalP93-GIk37显著提高了葡萄糖的消耗速率除了启动子文库，利用RBS文库对丁二酸转运蛋白DcuB和DcuC单基因调控，也可提高向细胞外转运丁二酸的能力和产量。

(2)多基因调控:单基因调控只能在单基因维度上操作，即使组合调控，其文库的容量也大大减小，很难筛选出多个基因的最优组合。在代谢途径的优化中,为实现目标化学品的高效生产，常需要多个基因的协同表达才能达到代谢途径的优化。Keasling团队开发了一种可调控基因间区域(Tunable intergenic region，TIGRs)文库技术。该技术基于基因间序列改变会对基因表达强度产生影响的原理，实现了在一个操纵子内同时对多个基因的表达强度调控的目的。使用这一技术，大肠杆菌中甲羟戊酸途径的多个基因实现了协同表达,甲羟戊酸产量提高了7倍。Isaacs 等开发了多重自动基因组编辑技术(Multiplexautomated genome engineering，MAGE)，该技术利用Red同源重组系统，通过自动化循环设备，对多个基因位点进行循环编辑，提高了基因编辑效率。基于CRISPR/Cas9技术，在染色体上实现对木糖代谢途径3个基因文库调控，筛选到的最优菌株，其木糖代谢速率提高了3倍。

（3）基因动态调控:动态调控是代谢途径优化中最有效的策略之一。虽然静态调控如单基因和多基因调控易操作、效果显著，但细胞内代谢物是动态的，若相关基因表达量过高会浪费细胞资源，过低表达又会限制代谢通路，最终目标产物的产率和产量受细胞代谢失衡而难以提升。为了适时地平衡产物合成所需的基因表达与全局代谢水平的关系，基因动态调控的引入能够实时响应代谢信号，并及时进行反馈调节,适应细胞内部代谢和环境的变化。

总结

大肠杆菌由于遗传背景清晰，又具备极为丰富的代谢元件库和完备的基因组编辑技术，成为了最适合进行代谢工程改造实验的底盘菌株之一。近年来，大肠杆菌在CO2 固定和甲醇利用方面取得了一系列的新进展，经过代谢工程改造的大肠杆菌甚至能够以甲醇为唯一碳源生长，在碳的循环利用方面作出了突出贡献。随着人工智能以及工程化理性设计的发展，结合日益丰富先进的生物技术，大肠杆菌代谢工程将实现理性化、工程化、智能化的革命。

参考文献：
[1]Production of itaconic acid from acetate by engineering acid‐tolerant Escherichia coli W[J] . Myung Hyun Noh,Hyun Gyu Lim,Sung Hwa Woo,Jinyi Song,Gyoo Yeol Jung. Biotechnology and Bioengineering . 2018 (3)
[2]The Supercritical CO2 Huff-n-puff Experiment of Shale Oil Utilizing Isopropanol[J] . Shengxiang Shang,Mingzhe Dong,Houjian Gong. IOP Conference Series: Earth and Environmental Sc . 2018 (3)
[3]Microbial production of mevalonate by recombinant Escherichia coli using acetic acid as a carbon source[J] . Xu,Xie,Zhao,Xian,Liu. Bioengineered . 2018 (1)

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