酵母表达系统是广泛应用于外源基因表达的系统之一，酵母作为基因工程表达系统，既有像原核细胞那样生长、繁殖速度快和表达量高的特点，又具有像真核生物那样的蛋白质翻译后加工和基因表达调控的特征。酵母作为工业微生物的主要菌种，在工业化发酵方面已经积累了大量的经验。用于表达外源基因的酵母表达系统也多种多样，其中的甲醇酵母表达系统是应用最广泛的表达系统之一。

甲醇酵母表达系统的优点：由于该表达系统属于一种真核表达系统，可对表达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰、具有高的表达量、只需简单的含盐华体会体育最新地址 即可、适合于高密度培养、背景杂蛋白少、表达产物较易纯化等优点。对影响酵母表达系统外源蛋白表达水平的因素进行分析，从而找到合适的解决办法尤为重要。

①外源基因序列的内在特性

为了获得更高的蛋白表达产量，应尽量使外源基因mRNA 5-UTR尽可能和AOX1 mRNA 5'-UTR相似，并且最好是保持两者一致。此外， 5UTR中应避免AUG序列以确保mRNA从实际翻译起始位点开始翻译，并且可以通过密码子的替换防止在始密码子AUG周围形成二级结构。(A+T)含量高的基因在甲醇酵母中表达时有时会造成转录的提前终止，因此，对于(A+T)含量较高的基因，最好是对序列进行优化或者重新设计，使其(A+T)含量在30%~55%的范围内。

外源基因的表达也会受到酵母偏爱的密码子的影响，因此通过对外源基因的密码子，将稀有密码子替换为酵母偏好型的密码子，可提高外源蛋白的表达产量。

②外源基因的拷贝数

通常情况下会认为甲醇酵母中所整合的外源基因拷贝数愈高，则蛋白表达量愈高。而实际上，高的基因拷贝数和高的蛋白表达量之间并无必然的联系，因此，在筛选出高拷贝转化子鉴定表达的同时，有必要选取单拷贝的转化子作为对照，比较两者表达量之间的差异。

③菌株的表型

外源基因转化至甲醇酵母后，可以整合到其染色体上。整合的不同方式会导致转化子出现两种表型：一种方式是插入，即整合后AOX1基因是完整的，没有被破坏掉，此种转化子代谢甲醇的能力正常，可以在含甲醇华体会体育最新地址 上正常生长，该种表型称为Mut；另外一种方式是替换，即整合后的外源基因取代了受体菌染色体上原有的AOX1基因，造成AOX1基因的丢失，此种转化子代谢甲醇的能力很弱，在甲醇华体会体育最新地址 上生长也很慢，这种表型称为Muts，如果是在胞内表达蛋白，优先考虑使用Muts表型，因为它们有一个低水平的乙醇氧化酶蛋白，使用该表型的菌株表达的蛋白更容易纯化；对于分泌表达，则Mut和Muts都均可使用。

④分子伴侣

分子伴侣在细胞内主要作用是帮助其他蛋白完成正确的组装或折叠但不参与这些蛋白所行使的功能，在组装或折叠完成后就会与该蛋白分离。大量的研究报道，分子伴侣与靶基因共表达可显著提高靶蛋白的表达量。

⑤信号肽

在毕赤酵母中表达的重组蛋白如果需要分泌到胞外必须经过信号肽的引导，由于信号肽与目的蛋白融合表达，从而使目的蛋白在加工折叠后被引导分泌到胞外。常用的酵母信号肽主要有a因子信号肽(MF-a)、酸性磷酸酯酶信号肽(PHO1)、Killer毒素信号肽、蔗糖酶信号肽(SUCZ) 和菊粉酶信号肽(INU)等。

⑥糖基化修饰

有研究表明，通过对糖基化位点进行改造或引入新的糖基化位点可提高分泌蛋白在毕赤酵母中的表达产量以及提高重组蛋白的活性。

⑦发酵工艺

高密度发酵是提高毕赤酵母重组蛋白表达量的一种重要策略。毕赤酵母表达外源蛋白时，温度、pH、碳源、氮源、溶氧等培养条件对所表达的目的蛋白的完整性及产量有着较大的影向，优化培养条件可有效提高外源蛋白的产量。对华体会体育最新地址 的优化主要包括对碳源的优化、氮源的优化、基础盐和PTM1微量盐的优化。有多种华体会体育最新地址 ，如BMGY/ BMMY、BMG/BMM， MGY/MM等都可以用来表达分泌蛋白，并且可以在一个广泛的范围内获得较佳的蛋白产量，尤其是当pH值对外源蛋白活力非常重要的情况下。甲醇浓度对目的蛋白的表达起着非常重要的作用，诱导期间需在华体会体育最新地址 中每天补加甲醇，以补偿甲醇的消耗和蒸发，一般每天添加到华体会体育最新地址 中的甲醇含量为华体会体育最新地址 体积的0.5%即可。诱导前的OD值也会影响外源蛋白的表达，高OD时诱导会受到溶氧和营养供给的限制，事实上在高的细胞密度下进行诱导不一定会提高表达产物的量，这主要依赖于所表达外源物质的特性，如稳定性，溶解性，毒性等。毕赤酵母可以在较宽泛的pH范围内表达外源蛋白，因此可以通过调节pH值抑制蛋白酶的活性，使蛋白酶对表达蛋白的降解程度降至最低，从而提高外源蛋白的产量。此外，在华体会体育最新地址 中添加1%酪氨酸蛋白水解物也可减弱蛋白酶对表达蛋白的降解作用。根据经验，发酵罐表达的蛋白产量较摇瓶高，这主要是因为在发酵罐中，溶解氧水平、搅拌速率、pH值、营养补给等方面更容易得到优化，更容易筛选出优异的表达条件。