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随着近二三十年来抗体药物的飞速发展，其抗体纯化生产工艺流程也已非常成熟，作为抗体生产中非常重要的一环，下游纯化在整个生产工艺中占据了非常高的成本，其中最主要的是填料成本，如果使用一次性耗材，在菌体发酵完成后，对发酵液进行澄清所使用的深层滤器及除菌滤器也占据一定的成本。针对下游纯化工艺，有研究者发现使用磁珠纯化的方式可以省去发酵液澄清的过程而直接进行纯化，大大提高了下游纯化的效率。本文分享一篇使用ProtienA磁珠从中试规模的发酵液中进行纯化抗体的先进方法。

文章研究了利用高载量Protein A琼脂糖磁珠从中试规模未澄清的CHO细胞液中亲和纯化单克隆抗体（mAbs）。悬浮液中IgG浓度为1 ~ 8 g/L时，Protein A磁珠的最大结合载量可达到65 mg/mL，为了保证较高的回收率，纯化抗体时通常按照吸附载量为25 ~ 42 mg/mL进行计算。作者首先使用磁珠从26 L发酵液的澄清液中进行了抗体纯化测试。于此同时做了小规模的纯化，小规模纯化时直接使用磁珠从含有40 ~ 106 cells/mL的细胞培养液进行抗体纯化测试，获得了与26L发酵液中纯化相似的抗体吸附效率。此后，作者还尝试了在16 L的分批补料过程中的未澄清的细胞培养液中进行了两次中试规模的抗体纯化，磁珠与发酵液孵育1 h达到了96.6%的吸附效果，在该纯化过程中，共使用了1 L的磁珠，最终该工艺抗体纯化回收率为86%，浓缩因子为16倍。使用ProtienA磁珠单步捕获，即可获得与柱层析相近的单克隆抗体纯度，同时HCP残余量<10ppm。此磁珠纯化工艺使用专用的中试规模分离设备，通过一个非常高效的单一步骤即可直接使细胞培养与下游纯化相连接，无需细胞澄清过程。与传统的柱层析分离方法相比，使用磁珠纯化的方式可以显著节省大量资源、如耗材，操作时间和设备等。

一、实验材料和方法：

1.1实验使用的发酵液为CHO M稳定细胞系表达的hIgG1

1.2纯化介质：①ProteinA琼脂糖磁珠，载量与MabSelect SuRe相近，②MabSelect SuRe填料

1.3ProteinA琼脂糖磁珠载量确定方法：取50μL磁珠分别加入至1mL的0.5-5 mg/mL IgG1（PBS体系）混合,在室温下旋转孵育2 h后，通过测定上清液UV 280nm紫外吸光度值得到为结合至磁珠上的IgG1浓度，通过反推计算出结合至磁珠上的IgG1的量。动态磁珠结合载量定义为在1h时，在固定总体积的条件下，调节磁珠与抗体样品的比例，在磁珠可以结合90% 游离IgG1（浓度1、2、4、6、8 g/L，PBS体系）时的载量即为磁珠的动态结合载量。

1.4在含有或不含有CHO细胞情况下，用磁珠从发酵液小量纯化的方法：分别取1.5 mL 发酵液样品，一份为未经离心澄清处理，一份经过离心澄清处理细胞收获液，与83 μL ProteinA磁珠在室温下颠倒混合孵育90分钟。使用磁力架将孵育液中的磁珠吸附至管壁上，吸出全部上清液，部分用于SDS-PAGE分析。然后使用0.9 mL PBS洗涤磁珠5次。最后使用1.86 mL pH 2.8，60 mM柠檬酸盐洗脱液将结合在磁珠上的抗体洗脱下来。

1.5在含在或不含有CHO细胞情况下，使用磁珠对hIgG1中试规模（26L）纯化方法：取1 L proteinA磁珠固体，用PBS缓冲液分次进行平衡，然后加入至16.25 L新鲜的未经澄清处理的细胞发酵液中进行孵育，形成混合液A。在5、10、15、30、60和120min时各取出1ml混合液样品，用离心机离心，保留上清液用于后续分析。在孵育至120分钟时，使用低剪切力蠕动泵以100 L/h的速度将混合液A转移到磁分选器上，用可伸缩磁棒吸附磁珠，使磁珠和液体进行分离。分离完全后，移去液体，移除磁分选器后，用PBS缓冲液重悬磁珠以对磁珠进行洗涤。再次使用磁分选器捕捉磁珠，去除洗涤液。按照磁洗涤方法，在完成洗涤循环后，用磁分选器将磁珠被转移到洗脱液中，移除磁分选器，使磁珠重悬于洗脱液中进行抗体的洗脱。洗脱时使用100 mM pH 2.8的柠檬酸盐溶液将吸附在磁珠上的抗体释放出来，然后使用0.22 μm Millipak过滤器（Merck）对洗脱液进行过滤处理。共收集2.9 L洗脱液于容器中。在洗脱期间，以相同的时间间隔取样48份的50 mL洗脱液，于280 nm处测量UV吸光度，然后将所取的样品进行混合。在病毒灭活步骤中，将洗脱的抗体保持在低pH条件下孵育1小时，然后加入310 mL 2 M pH 9.0 Tris HCl，使洗脱液pH恢复至中性。

二、实验结果

文章作者使用Langmuir吸附等温线对实验结果进行拟合，其结果显示磁珠静态结合载量(吸附饱和时的载量)随着单抗初始浓度的增加而增加（图1A）。随后通过线性化Langmuir等温线（Hanes plot）计算了磁珠的最大结合载量Qmax，其中1/斜率即为Qmax（图1B），根据计算结果，磁珠的最大结合载量Qmax约为65mg/mL。静态载量虽然可以一定程度上的反应磁珠的吸附抗体的性能，但是动态载量对于抗体纯化过程会更具有意义。同样的在使用磁珠纯化抗体时，对ProteinA 磁珠的动态吸附载量的测试比静态载量也更有意义，磁珠动态载量的测定方法前文已进行详述。根据作者的实验结果，磁珠的动态结合载量随抗体初始浓度的增加而增加，直到抗体浓度超过7 g/L，达到最大42 mg IgG/mL磁珠值（图1C）。

在中试规模生产中，从总体积2.5 L的连续洗脱液中分别收集到9.5和0.5g 抗体，总收率为87.4%（图3A），浓缩因子为10倍。通过UV监测第一次洗脱的收集组分，显示出一个几乎对称的洗脱峰形（图3B）。验证了使用磁选机和磁珠从中试规模的上清液中纯化单克隆抗体工艺的可行性。并且在含有有或不含有细胞的情况下，使用磁珠对单抗的捕获效果无明显差异（图4）。

作者对三次不同规模的实验结果进行了分析和总结（表1）。

使用磁珠亲和捕获的一个优点是产品捕获可以与投料同时进行。在实验开始的5分钟内超过一半的抗体可被磁珠捕获，在30分钟和1小时平均分别有88%和97%的抗体被结合（图5A）。这种快速吸附效率可以在SDS-PAGE中直观地反映出来（图5C）。另外，使用含有细胞收获发酵液进行的小规模实验也验证了细胞的存在对该工艺不存在明显影响（图6）。使用非澄清细胞发酵液和离心去除细胞后的发酵液分别获得93%和95%的收率。值得注意的是，Run B1和Run B2洗脱产品中HCP水平均在10ppm/mg以下，LRV在2.9以上。可能原因时使用磁珠纯化的工艺过程在很大程度上保证了细胞的完整性从而减少了HCP以及宿主DNA等内源性物质的释放。在和5 mL HiTrap MabSelect SuRe 层析柱的对比试验中，ProteinA磁珠具有更高的收率（88% > 86%）和可比的纯度（图7），进一步体现了磁珠纯化抗体工艺的优势。