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导读：《Nature》期刊发表的一篇文章《Naturally-occurring cholesterol analogues in lipidnanoparticles inducepolymorphic shape and enhanceintracellular delivery ofmRNA》就提到了关于脂质纳米颗粒（LNP）中天然存在的胆固醇类似物诱导多态性并增强mRNA的胞内递送的相关问题。

本文分为4个部分：

Part 1概述LNP基本概念；

Part 2展现LNP具体作用；

Part 3制定改善LNP内体逃逸具体方法；

Part 4得出LNP满足胆固醇类似物诱导多态性并增强mRNA的胞内递送结论。

mRNA领域的作用研究一直是生物工程领域炙手可热的方向，RNA药物的兴起促进了无数不可药用疾病的潜在治疗方法的发展，mRNA新冠疫苗也逐渐进入大众的视野。 Science相关长文报道有指出：mRNA疫苗开发的关键即是LNP。

Part 01 LNP基本概念

脂质纳米颗粒（LNP）是mRNA药物常用的载体。mRNA疫苗需要特殊的修饰或包裹递送系统才能实现mRNA的胞内表达，递送技术是限制mRNA药物/疫苗发展的瓶颈。LNP是核酸药物研究应用最多的递送系统之一，目前上市的mRNA疫苗都是采用了LNP来递送药物。

LNP是一种多组分系统，通常由可电离脂质或阳离子类脂质化合物、辅助脂质、胆固醇、保护剂聚乙二醇-脂质共轭物组成。每种LNP都由4种辅料构成，包括可电离脂质（与mRNA结合，将其电荷由负电荷转化为电中性，同时限制颗粒毒性）；另3种脂质可以维持粒子的结构并提高稳定性。

图1 LNP结构

Part 02LNP具体作用

目前临床前和临床研究正在利用LNP包装和递送mRNA以诱导蛋白质的快速产生，用于治疗传染病，癌症和罕见的遗传疾病，以及用于细胞和遗传操作已是常态化。

但脂质基纳米颗粒（LNP）的内体隔离仍是递送的一个巨大障碍。胆固醇类似物的结构活性分析表明，需要将C-24烷基植物甾醇掺入LNPs（eLNP）可增强基因转染，且需要烷基尾部的长度、甾醇环的灵活性和-OH基团的极性来保持高转染。与球形LNP相比，Cryo-TEM显示ELNP的多面体形状，而x射线散射显示内部结构几乎没有差异。eLNP表现出更高的细胞摄取和保留，可能导致内体随时间稳定释放。3D单粒子跟踪显示eLNP相对于LNP的细胞内扩散性增强，表明eLNP向生产途径逃逸。

LNP的制剂涉及有机相：即由可电离的脂质二亚油酰基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯（DLin-MC3-DMA），辅助脂质（1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（DSPC）的快速微流体混合和胆固醇，以及1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-甲氧基聚（乙二醇）2000（DMG-PEG2k）与含有核酸的酸化水相。这些纳米颗粒组织成核-壳结构，其中核含有与可电离脂质静电复合的核酸，胆固醇提供结构完整性。同时，DSPC和PEG-脂质主要存在于表面上，同时一部分可电离的脂质和胆固醇形成LNP的壳。对LNP递送机制的研究表明，在给予血流后，LNP表面上的PEG-脂质被交换为血清蛋白，包括促进受体介导的细胞进入的ApoE（图1a）。有人提出，在低内体pH下LNP内可电离脂质的质子化促进与阴离子内体膜的静电相互作用，引发核酸向胞质溶胶的释放。然而，最近研究表明，大多数LNP被困在降解的内吞室内或被排出细胞外，只有一小部分（<2%）到达胞质溶胶。内体逃逸过程仍然是成功进行基因传递的最大障碍之一。

Part 02改善LNP内体逃逸具体方法

笔者团队的研究结果表明了胆固醇在携带mRNA的LNP的亚细胞转运中的重要性，并强调需要更深入地了解纳米颗粒的表面组成和结构特性，以及它们的亚细胞相互作用，这使得设计能够改善内体逃逸。

通过筛选或设计可干扰内体的新的可电离脂质可增强核酸递送。例如，已显示在纳米颗粒制剂中包含胆固醇可改善功效，这可能是由于膜融合增强。据推测，胆固醇可能以结晶形式存在于LNP表面，在那里它可以促进内体逃逸。强调胆固醇对细胞内递送的影响程度，胆固醇和胆固醇转运蛋白也被认为在病毒的细胞溶质递送和纳米颗粒的内吞再循环/保留中发挥作用。

根据上述知识，笔者团队决定解码胆固醇的结构特征，可有效地促进细胞内递送和基因转染的改善问题。但胆固醇的结构类似物作为天然产物存在巨大差异，于是笔者团队生成了一系列被各种天然胆固醇类似物取代的LNP，以揭示胆固醇结构对基于mRNA的基因转染的作用。文章中鉴定了一类在C-24处具有烷基取代的胆固醇类似物，当其掺入增强的LNP（eLNP）内时，其可导致基因递送的显着增加。此外，这些eLNP在形态上与传统的LNP不同。eLNPs的细胞内行为也不同，表明结构畸变和潜在改变的表面脂质组成可导致差异运输。可以看到更多数量的线性轨迹，以及细胞内摄取和保留的增加。通过使用胆固醇类似物，可以改进纳米颗粒结构，可能由表面组成产生，导致纳米颗粒的细胞内运输，从而增强细胞溶质递送。

图2 筛选胆固醇类似物以增强基于mRNA的基因转染

a：显示PEG脂质从LNPs的脱附允许ApoE结合，导致细胞中LDL介导的细胞摄取。

b：IUPAC-IUB命名法（1989）胆固醇环系统，具有环（A、B、C和D），碳编号从C-1到C-29。

c：胆固醇结构。

d：示意图显示胆固醇分为三个区域：头部、身体和尾部。

e：胆固醇类似物的分类-第I、9、10类甾体，第II-C-24类烷基类固醇，第III类五环类固醇。胆固醇的结构变化以红色突出显示。

f：筛选胆固醇类似物的粒径（nm）、mRNA包封率（%）和转染效率（200ng mRNA）。

筛选用胆固醇类似物配制的LNP胆固醇可分为三个区域：头部，身体和尾部（图1b–d）。胆固醇的头部以–OH基团的形式位于环A中，C-3在环上方倾斜。在脂质体制剂中，假设该–OH基团通过其极性和氢键与水相相互作用。该体由含有三个环己烷或环己烯环（A，B，C）和一个环戊烷环（D）的稠合四环体系（1,2-环戊基对苯二酚）组成。尾部由环D（图1b-d）位置17处的饱和烷基侧链（C-20至C-27）组成。尾巴中的右手构象，饱和度和缺乏官能团对于允许灵活性是必不可少的。身体和尾巴一起有助于疏水性脂质双层的有序形成。因此，胆固醇已被证明可以增加凝胶膜的流动性，同时诱导流体膜的有序性。

初步筛选后，笔者团队根据与胆固醇环系统的结构相似性选择了三组类似物。第I组由维生素D衍生物组成，维生素D衍生物与尾部修饰或不修饰的体内胆固醇不同，第II组含有烷基取代的类固醇，与尾部单独的胆固醇不同，而第III组具有胆固醇类似物，其中尾部修饰成第5环（图1e）。

图3 增强基因转染的C-24烷基衍生物的结构特征

a–d：C-24烷基衍生物在尾部和身体中有变化，对其大小、mRNA包封效率（EE）和LNPs转染效率的影响进行了筛选（10–200b和50中C-24烷基衍生物的每孔ng mRNA对于d）中双键的顺序添加，每孔ng-mRNA。胆固醇和β-谷甾醇的这些结构的变化分别用红色和黄色表示。

e–f还评估了用氨基酸（极性）或乙酸盐（非极性）对β-谷甾醇头部基团的结构修饰对纳米粒子大小、封装和LNPs转染的影响（200ng-mRNA每孔）。色码表示极性（绿色）、非极性（黄色）和与胆固醇的结构差异（红色）。水平红色虚线表示设置为100%的eLNP表达式。

笔者团队接下来研究了其他C-24烷基和烯基替代物是否可以改善LNP功能。C-24烷基甾醇属于植物甾醇的多功能组，在构成植物细胞的膜组成和动力学方面具有关键作用。先前研究表明，C-24烷基植物甾醇诱导的晶体缺陷与烷基侧链的长度（胆固醇<樟脑<β-谷甾醇）成正比。因此，我们选择了三种额外的植物甾醇，即豆甾醇（β-谷甾醇类似物，由于甾醇环中Δ−5双键的减少，具有高度柔性体）、岩藻甾醇（由于不饱和，尾部乙基的柔性受限）和樟脑（由于C-24甲基，尾部烷基取代长度减少）（图2a）。这些纳米颗粒的大小相当（~100nm），并且表现出高封装（>90%）（图2a），并且在转染方面优于基于胆固醇的LNP，提高了11至211倍（图2b）。这些发现证实了C-24烷基胆固醇类似物的优越性，无论C-24烷基链的Δ−5双键和不饱和度或长度如何（图2a，b）。

此外，笔者团队还研究了C-24烷基取代的本体和尾部刚性对LNP功能的影响。选择另外三种植物甾醇，即油菜甾醇（低刚性C-24甲基类似物，尾部区域有一个双键）、麦角甾醇（中等刚性C-24甲酯类似物，在尾部区域有1个双键，在身体区域有1条双键）和9，11-脱氢麦角甾醇（高刚性C-24甲醇类似物，尾巴区域有一条双键，身体区域有两条双键）（图2c）。这些纳米颗粒的大小相当（~100nm）至eLNP，并表现出中等高的封装（>80%）（图2c）。令人惊讶的是，所有的类似物都显示出适度的（油菜甾醇和麦角甾醇约50%）或无转染（脱氢麦角甾醇）， 这表明C-24烷基胆固醇类似物的身体和尾部区域灵活性的重要性 （图2c，d）。通过上述情况可以推测，油菜甾醇未能以图2a，b中其他类似物的效率封装和转染，这可能是由于LNPs32中不同脂质组织不当。此外，在身体区域中顺序引入双键（图2c）可能降低甾醇的膜有序化能力，导致转染效率大幅降低（即从麦角甾醇到9，11-脱氢麦角甾醇）。

为了确定β-谷甾醇头部在LNP疗效中的作用，笔者团队将β-谷固醇类似物考虑其中（图2e）。由于只有一种天然的β-谷甾醇C-3类似物（即daucosterol，一种β-谷固醇糖苷）是现成的，于是笔者团队合成了多种具有极性（甘氨酰、精氨酰、组氨酸、丝氨酸和胱氨酰）和非极性（乙酰基）基团缀合物的合成C-3类似体（补充图4），且测试功效。但无论包封或大小，极性取代基的转染效率都很低，而精氨酸和非极性取代物（乙酸盐）尽管大小和包封相似，均未能转染（图2e，f）。故文章推测C-3位置极化率的变化可能导致封装和转染减少。此外，–OH基团被溶酶体转运蛋白识别，溶酶体转运蛋白将胆固醇转运至内质网。可以假设–OH基团的修饰导致胆固醇转运蛋白对底物的识别率不同，从而降低转染效率。

图4 纳米颗粒的细胞内递送和内体逃逸

外源性胆固醇通过低密度脂蛋白（LDL）输送到细胞来维持细胞内稳态，低密度脂蛋白颗粒将酯化胆固醇包裹在非极性核心内，胆固醇被最终定位于LE/Ly且进行去酯化。两种伴侣蛋白，分别是Niemann-Pick C-1型（NPC1）和Niemann-Pick C-2型（NPT2），分解LDL并介导胆固醇从LEs逃逸到细胞质、内质网或质膜。NPC2是一种可溶性蛋白，与胆固醇的疏水尾部结合，并将其头部（即–OH）呈现给NPC1的N-末端结构域（NTD），NPC1是一种跨膜蛋白，位于将胆固醇分流出去的溶酶体表面。已经表明，在NPC1导向的过程中，约70 %的内化纳米颗粒从晚期内体/溶酶体循环到细胞外空间。NPC1的缺失导致核酸在晚期内体/溶酶体中的滞留增强，这转化为改善的胞浆递送。此外，C-24烷基衍生物的细胞内运输已被证明在内膜中受到限制。

通过上述可以得出假设， 用胆固醇类似物替代纳米颗粒可能调节NPC1/2活性，从而减少eLNP流出，从而改善细胞内可用性和mRNA递送 。与LNP相比，eLNP在HeLa细胞中的保留率更高，进一步加强了这一观察（图4b，c）。NPC1中的细胞缺陷导致LNP和eLNP的转染增强，eLNP再次显示出优异的效率（图5a，b），而NPC2缺陷细胞在eLNP介导的基因递送中的相对增强较低（图5c）。这些研究表明， 内体循环中的缺陷有助于增强纳米颗粒的内体逃逸。C24烷基衍生物与内体外排机制的差异结合可能导致eLNPs56的更高保留 。

Part 04 结论

通过上述文章可以得知， 细胞内递送的增强可能与纳米颗粒的表面组成和结构及其随后的亚细胞相互作用有关 。LNP和eLNP可能遵循类似的初始摄取途径，之后可电离脂质质子化并与内体膜静电结合，导致核酸逃逸。但eLNP的优势可能源于其由于β-谷甾醇的掺入而增加了细胞内部的脆性，这种脆性来源于表面组成和形状的改变，可能促进eLNP与内体膜的融合。eLNP的形状和表面脂质组成可能导致运输方式不同，从而驱使其进入更适合从内体逃逸的特权途径。且可能由于eLNP与溶酶体转运蛋白相互作用的减少，eLNP的更高保留率为它们提供了足够的停留时间，以逃离内体，随后导致核酸递送增强以满足胆固醇类似物诱导多态性并增强mRNA的胞内递送。

参考文献

[1] Siddharth Patel , N. Ashwanikumar , Ema Robinson , Yan Xia, Cosmin Mihai, Joseph P. Griffith III, Shangguo Hou, Adam A. Esposito, Tatiana Ketova, Kevin Welsher , John L. Joyal, Örn Almarsson & Gaurav Sahay，Naturally-occurring cholesterol analogues inlipid nanoparticles induce polymorphic shapeand enhance intracellular delivery of mRNA，2020.02.20.

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