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酵母表达系统是广泛应用于外源基因表达的系统之一，酵母作为基因工程表达系统，既有原核生物那样生长、繁殖快速和表达量高的特点，又具有与高等真核生物十分相像的蛋白质翻译后加工和基因表达调控的特征。长期以来酵母作为工业微生物的主要菌种，在工业化发酵方面已经积累了大量的经验。本文主要讲述了毕赤酵母蛋白表达的原理，毕赤酵母表达能够高效表达的机制。

巴斯德毕赤酵母（以下简称毕赤酵母）能够高效表达外源基因，是因为其有更强的强启动子，即醇氧化酶启动子PAOX。甲醇营养型酵母能将甲醇分解为甲醛和过氧化氢，在此反应中参与的酶是醇氧化酶（AOX1和AOX2）。其中，AOX2的表达量比AOX1低得多，以甲醇为唯一碳源时，AOX1增至细胞总蛋白的40%。PAOX1受甲醇诱导和葡萄糖或甘油的抑制。因此，AOX1的表达受到甲醇的严格控制。

巴斯德毕赤酵母所表达的外源基因位于酵母染色体上，其主要是通过把携带外源基因的表达质粒线性化，以同源重组的方式整合到强启动子PAOX1的下游，目的基因一般插入到5’AOX1启动子和转录终止子之间的单克隆位点。

毕赤酵母蛋白表达系统

①酵母表达宿主菌

※Mut⁺和Mut^s

在毕赤酵母表达系统中，有两种基因编码乙醇氧化酶，即AOX1和AOX2。细胞中绝大多数乙醇氧化酶活力由AOX1提供，菌株利用甲醇的速度主要由AOX1基因表达的AOX1蛋白提供。当AOX1缺失，只存在AOX2时，大部分的乙醇氧化酶活力丧失，这种细胞利用甲醇能力低，在甲醇华体会体育最新地址上生长缓慢的菌株表现型为Mut^s。存在AOX1，细胞利用甲醇正常生长，在甲醇华体会体育最新地址上生长较快，这种菌株表现型为Mut⁺，这就是甲醇营养型毕赤酵母表达两种Mut^s和Mut⁺产生的原理。

※酵母表达系统常用宿主菌

GS115、KM71、SMD1168是常用的表达宿主菌，均为甲醇诱导型。他们都是组氨酸缺陷型，如果表达载体上带有组氨酸基因，可以补偿宿主菌的组氨酸缺陷，所以可以在不含组氨酸的华体会体育最新地址上筛选重组转化子。在以葡萄糖或者甘油等为碳源的华体会体育最新地址上生长时，AOX1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时，宿主菌的AOX1基因被强烈诱导，使目的基因大量表达。

※有无甲醇诱导产生的Mut⁺和Mut^s表现型

毕赤酵母的最适生长温度为28-30℃，诱导期间超过32℃，不利于蛋白表达，并可能导致细胞死亡。Mut ^s和Mut ⁺菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率一样，存在甲醇的情况下，AOX1启动子被强烈诱导，Mut ⁺较Mut ^s生长更快（4-5倍）。

②酵母蛋白表达载体

※酵母蛋白表达载体的选择

酵母表达产物有胞内表达和分泌到胞外表达两种方式，这取决于表达载体的选择和构建是否带有信号肽，可根据基因表达的定位及目的选择合适的酵母蛋白表达载体。

1).胞内表达载体：主要包括pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2等。该类载体将目的基因表达在胞内，可避免酵母的糖基化，适合于通常在胞浆表达或不含-S-S-的非糖基化蛋白，较胞外分泌表达水平高但纯化相对复杂。

2).分泌到胞外表达的载体：pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P等。酵母本身分泌的外源蛋白很少，将外源蛋白分泌到胞外，有利于目的蛋白的纯化和积累。常用的分泌信号序列由89个氨基酸组成α交配因子的引导。

3). 多拷贝插入表达载体：pPIC9K、pPIC3.5K。某些情况下，重组基因的多拷贝整合能够增加蛋白的表达量。

※表达重组蛋白使其具体天然的N端

想实现表达重组蛋白使其具体天然的N端，将目的基因直接连接在Kex2蛋白酶切位点之后。Kex2蛋白酶切位点在信号肽序列中谷氨酸和精氨酸连接处：Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala *位置为Kex2蛋白酶的酶切位点

毕赤酵母表达系统机制/原理

毕赤酵母能够高效的表达外源基因，是因为其具有强启动子 乙醇氧化酶启动子（AOX1和AOX2）。AOX1和AOX2及其产生的 Mut ^s 和Mut ⁺表现型前文已经叙述过。AOX1受甲醇的诱导和葡糖糖或甘油的抑制。毕赤酵母表达的外源基因位于酵母染色体上，通过把构建的质粒/载体线性化（主要采用酶切），通过同源重组的方式整合到启动子AOX的下游，一般是插入到5'AOX启动子和转录终止子信号之间的单克隆位点。

本公众号下次会介绍毕赤酵母同源重组的方式，欢迎关注！