细菌内毒素是热原的一种，来自革兰阴性菌的外膜。极微量的内毒素进入动物或人体内都会引发强烈的炎症反应，导致轻微如发热，重则死亡的严重后果。各国药监部门对生物产品中的内毒素含量均有严格规定。欧洲药典规定注射剂内毒素限度不得高于5 EU/(kg·h)，EU为内毒素单位，每EU内毒素约相当于100 pg。

细菌污染的风险在生物制药工艺中广泛存在。防止细菌污染，控制产品中内毒素含量是广大生物制药从业人员所面临的巨大挑战。生物药物中，单克隆抗体药物因为使用剂量大（几十到几百毫克），对内毒素限度的要求因而更高。单克隆抗体作为一类靶向药物，以其突出的疗效和较低的不良反应获得了医药界的极大重视，单抗药物的研发也异常活跃。单克隆抗体作为生物大分子药物，生产和纯化工艺复杂，有诸多环节可能将内毒素带入生产工艺之中。因此，纯化工艺步骤中有效去除内毒素的能力将为产品符合内毒素标准提供保障。

内毒素是脂多糖(LPS)，其结构包含3 个区域，即类脂A区、核心多糖区和特异性多糖区。其中，核心区的磷酸化导致内毒素在一般蛋白溶液中带负电荷。内毒素的类脂部分为疏水区，使内毒素可以像一些双极性分子一样形成微球或微囊结构，将疏水区包裹在里面。内毒素单体的相对分子质量为10kDa~20kDa，其聚合形态的相对分子质量可超过1000kDa。

因为内毒素分子结构复杂且不均一，导致内毒素可以多种方式与溶液中的蛋白质相互作用，形成复合物，大大增加了去除的难度。在蛋白溶液中去除内毒素需要着重考虑所用方法对内毒素的特异选择性，即尽量减小蛋白的损失，又对内毒素有较高的亲和力。多聚赖氨酸即表现出对内毒素有亲和作用，以其作为配体的层析介质可以选择性结合内毒素。因为内毒素一旦在水溶液中聚集，分子大大增加，膜过滤/超滤法有望通过分子大小的不同将内毒素与蛋白分子分离。同样利用层析原理，精氨酸溶液冲洗已被证明可以将附着在固定相上的单抗分子内毒素去除。

1，内毒素去除填料法：

内毒素去除填料是一款离子交换介质，由多聚赖氨酸共价连接在纤维素基质上制成。多聚赖氨酸在填料pH值范围内（pH6~8）带正电荷，可以与带负电荷的内毒素结合，并常用于去除内毒素的工中。蛋白溶液和内毒素去除填料混合孵育1 h 后，用Spin 柱收集流穿的抗体样品，发现起始含量分别为0.8EU/mg和8EU/mg，经过该填料纯化后其抗体中的内毒素均去除了70%，而单抗几乎没有损失。

如果目标抗体pI为pH8~9，这样带正电荷的蛋白质在阳离子交换柱中会有与层析介质竞争内毒素的现象，因此，用单纯的离子交换法去除带正电荷的蛋白质溶液中的少量内毒素是很困难的。虽然此方法可将内毒素含量从一个较高水平大幅降低，但残留的少量内毒素通过和蛋白质的相互作用而变得顽固，通过该方法很难进一步降低。

2，纳滤法

内毒素的结构包亲水特异性多糖区和疏水类脂A区，在水溶液中易形成聚合物。内毒素的这种分子复合体形成双层膜状结构，体积和分子都很大，在很多应用中可以利用这一特征使用孔径为20nm的纳米滤器对其进行过滤去除。有研究发现将含有250 EU/mL 内毒素的抗体溶液经纳滤后，其内毒素含量下降了89%。在使用纳滤去除内毒素时，对于高内毒素含量的样品，可能会堵膜的现象发生，此时可通过在纳滤前加一个0.1um的滤器进行处理即可解决堵膜的现象，大大提高膜的载量。

纳滤虽然可以去除形成聚合体的内毒素，但在蛋白溶液中，很多内毒素还是以单体形式存在的，并与蛋白质形成复合物，无法通过过滤的方法去除。

3，氨基酸清洗法

有研究者发现，将单抗结合在蛋白A柱上后，可以通过0.15~0.5M的精氨酸溶液(见A图)或者0.3~0.5M的组氨酸溶液(见B图)冲洗去除混杂在抗体中的内毒素，对纯化过程各阶段进行取样并测内毒素，结果显示洗脱后的抗体中内毒素含量大大降低。精氨酸或组氨酸冲洗去除内毒素的机理尚不清楚，但其残基带正电，可能利用电荷作用将内毒素与带正电荷蛋白质分开，达到去除的效果。

从满足工艺放大的条件上看，使用柱层析方法去除内毒素是最方便的。相比较内毒素与固定相结合的动力学特征，将单抗结合在层析柱上而使用不同的流动相洗去内毒素也更加方便。

总结：

对比三种内毒素的去除方法，内毒素去除填料价格高，操作时间长，内毒素去除较不彻底；纳滤法虽然适合中试水平单抗产品的内毒素去除，但仍不能充分降低残留内毒素水平；氨基酸清洗法可以有效地进行工艺放大，层析操作方便，且可将内毒素残留量降至0.25 EU/mg水平，达到中国药典的要求。将这一步骤整合入单抗纯化工艺中，将有助于对纯化产品中的内毒素水平进行控制。