一些标签对蛋白功能产生影响的风险很小，但另一些标签，尤其是那些大分子的标签，会对下游产生影响。因此，通常需要在初始检测后对目标蛋白的标签进行切割。标签的切割可以利用位点特异性蛋白酶或内含肽来实现。

位点特异性蛋白酶不应影响蛋白的功能，但通常需要在切割后去除蛋白酶。一种解决方案是使用一种自身已融合到亲和标签中的蛋白酶。然后通过亲和色谱法轻松去除蛋白酶。根据具体需求，可以存在多个蛋白酶识别位点，每个位点都有明显的优势和局限性。需要考虑的一点是，应将标签融合到N端还是C端。切割N端的标签，目标蛋白上剩下的过量残基最少。但是，切割C端的标签，则会在目标蛋白上留下4-6个多余残基。在特定情况下，也可使用羧肽酶去除这些较短的C端序列。下方列出了最常见的蛋白酶位点。

另一种方法是使用内含肽。内含肽是通过自催化从宿主蛋白中自行切除的蛋白片段。尽管这一方法无需使用蛋白酶，但存在一定局限性。首先，内含肽涉及催化机制的多个区域，增加了细胞的代谢负担，在增强溶解度或促进纯化方面没有任何积极意义。其次，使用内含肽的过程可能比较缓慢，且没有在高通量背景下进行过严格测试。最后，切割效率取决于融合连接处的序列背景。

有效的亲和标签可将几丁质结合域(CBD)与修饰后的内含肽序列相结合。尽管洗脱步骤需要蛋白水解切割，但标签和树脂的结合很牢固。

二、亲和标签

亲和标签之所以这样命名，是因为它们经常被用于亲和纯化。将亲和标签连接到目标蛋白上，可与固定在纯化填料上的配基通过化学或物理相互作用，将其从溶液中分离出。具体使用何种亲和层析方法，取决于所用的特定标签。以下介绍了一些最常用的亲和标签。

①GST标签

概述：

谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 是一种由211个氨基酸组成的蛋白，分子量约为26 kDa。天然GST负责保护细胞免受有害化合物和氧化应激的影响。GST的一个主要特性是其对三肽(谷胱甘肽)具有亲和性，可在亲和层析中使用。含有GST的溶液在经过偶联谷胱甘肽的色谱柱时，GST会与谷胱甘肽结合，将其与溶液的其余部分分离。建议使用接近中性的缓冲液，以便GST与固定化谷胱甘肽实现最佳结合。结合后，可以用10 mM谷胱甘肽洗脱GST。10mM谷胱甘肽是一种温和的洗脱剂，有助于保留融合蛋白功能。

注意事项:

污染：热休克蛋白有时会被GSH洗脱。可通过 SDS-PAGE检测该污染：HSP70 将表现为70kDa的双重带，而 HSP60和HSP10则将表现为68kDa左右的谱带。为去除热休克蛋白污染物，纯化前用 5mM MgCl2和5mM ATP处理细胞裂解液。

蛋白功能丧失：由于GST是一个大标签，可在溶液中自然二聚化，因此可能会降低蛋白的活性或功能。这一问题可通过蛋白酶（如凝血酶、Xa 因子或 PreScission）从您的目标蛋白中切割GST来解决，该步骤可在结合谷胱甘肽色谱柱时进行。

②His标签

概述:

His标签由于体积小且结合稳定，因而广泛用于蛋白纯化。尽管标签可以是 2-10个组氨酸残基，最常见的 His标签为 6xHis标签或hexatag，后者包含 6个组氨酸残基。组氨酸会与固定化过渡金属离子形成配位键，这一特性可用于蛋白纯化。虽然钴和锌色谱柱都可用于固定化金属亲和层析(IMAC)，但通常使用镍柱。虽然标签的最佳位置具有蛋白特异性，但由于His标签是短肽序列，它们很少影响融合蛋白的特性。

注意事项:

内源性His：由于哺乳动物和昆虫系统中普遍存在His残基，因此使用这些系统时可能出现较高的背景。可以通过在洗杂液中加入5-10mM咪唑进行清洗来减少非特异性结合。

使用具有金属中心的蛋白：不建议将具有金属中心的蛋白与His标签融合，因为金属可能会被亲和树脂吸收。

厌氧条件：应避免厌氧条件，因为其可能会削弱亲和树脂。

③生物素标签

概述:

生物素又称维生素H，是一种分子量为244Da的小分子物质。它是一种常用的分子工具，常与二抗偶联，用作ELISA和Western Blot检测的可视化技术。生物素能够与链霉亲和素和亲和素分子形成非常强的键，这一特性可用于亲和纯化。由于生物素是小分子，因此不太可能影响蛋白功能。

另一个标签是Strep标签，由于其长度为8个氨基酸(WRHPQFGG)，因此也不太可能影响蛋白功能。而且它还能够可逆地和与生物素在相同的穴区结合。融合了Strep标签的蛋白可以使用链霉亲和素树脂进行纯化，并切可以在温和的缓冲液中使用生物素进行洗脱。

注意事项:

四聚体与单体亲和树脂：对于生物素标记的蛋白，可以用偶联亲和素的色谱柱进行纯化，该色谱柱有四聚体形式和单体形式。四聚体亲和素色谱柱的洗脱过程需要强效变性剂，如尿素或盐酸胍，而单体树脂可以使用10mM生物素缓冲液进行较温和的洗脱。

在哺乳动物系统中的使用：哺乳动物系统包含至少4种生物素化蛋白，可能会与目标蛋白共洗脱，但是，在大肠杆菌系统中很少遇到非特异性结合。

三、表位标签

表位是抗原被抗体识别的部位，因此在基于抗体的检测中经常使用的标签被称为表位标签。表位标签的长度通常比亲和标签短，因此不太可能影响蛋白功能。虽然表位标签可以用于亲和纯化，但色谱柱需要偶联抗体，使得制备色谱柱的成本很高，因此不如使用亲和标签的色谱柱有效。但是，由于它们对各自一抗的特异性，表位标签仍是检测融合蛋白的有效工具。表位标签广泛用于细胞培养和免疫沉淀(IP)，包括蛋白复合体免疫沉淀(co-IP)。

①c-myc标签

概述:

人c-myc在增殖细胞中低水平表达，在人肿瘤发生中起关键作用。c-myc标签来源于c-myc基因的c端，能被抗体有效识别，因此在Western Blot、免疫沉淀和流式细胞术等应用中广泛用于蛋白检测。

注意事项:

融合到分泌信号：虽然c-myc标签可以放置在C端，也可以放置在N端，但不建议将标签与分泌信号融合，因为这样会影响到分泌通路的易位。

亲和纯化：虽然c-myc标签可用于蛋白纯化，但很少用于此目的。这是由于洗脱所需的低pH值可能对蛋白功能产生负面影响。

②HA标签

概述:

人流感血凝素(HA)标签来源于HA糖蛋白，存在于流感病毒表面，是造成病毒传染性的主要原因。由于HA-tag是一个小型多肽标签，因此对蛋白功能的影响很小，对通过ELISA、Western Blot、免疫沉淀和免疫荧光检测蛋白来说是一个有价值的工具。抗HA抗体可以固定在琼脂糖微珠上进行蛋白纯化。

注意事项:

亲和纯化：不建议对来源于凋亡细胞的蛋白使用HA标签。HA标签可被Caspases3和7切割，致使免疫反应性丧失。

③FLAG标签

概述:

FLAG标签的亲水性高于其他表位标签，因此不太可能影响与其融合的蛋白的功能。FLAG标签包含DDDK序列即肠激酶切割序列，因此可以轻松地从目标蛋白中去除。

注意事项:

亲和纯化：虽然偶联抗Flag抗体的色谱柱对纯化Flag标签的特异性很高，但该亲和色谱柱价格昂贵。

④V5标签

概述：

V5标签来源于副粘病毒猴病毒5的P和V蛋白。V5标签的大小有两种，范围在9-14个氨基酸之间，但通常使用长一点的标签。有时建议将V5标签与His标签结合使用。

注意事项:

交叉反应性：如果您正在使用哺乳动物表达系统，则有可能发生交叉反应。

四、荧光标签

自1992年克隆出原始的绿色荧光蛋白(GFP)基因以来，可用的荧光标签种类激增。荧光标签的一大的优点是无毒，因此可以用于活细胞检测。尽管标签较大，但它们对大多数蛋白的破坏力极小。虽然GFP(分子量为26.9 kDa)是应用最广泛的荧光标签之一，但使用时仍需考虑几个要点。

①激发、发射和亮度：

如果计划使用多个荧光标签，需选择具有不同激发峰及发射峰的标签，以便使用激光靶向标签。如果发射峰重叠，将很难或者几乎无法对其进行区分。为了获得清晰的信号并克服任何潜在的背景荧光，通常希望在可用光谱中使用最亮的荧光标签。亮度值是蛋白消光系数和量子产率的乘积，但是，很难解释得到的数字，因此通常会使用严格定义标签(例如EGFP)的荧光标签亮度值作为替代。

②Maturation和bleaching：

Maturation定义了荧光标记正确折叠、形成发色团和开始发射荧光的时间。在活细胞的time-sensitive事件中，一个短的maturation的时间至关重要。sfGFP为例，可以在10分钟内折叠，而mOrange通常要4个小时。

Bleaching是光稳定性的度量。即发色团在被激发后多长时间内失去发射光的能力。如果你打算进行一个长时间的延时实验，那么要考虑一个具有很高的光稳定性的标签。T-sapphire的bleaching半衰期是25秒，而EGFP则稳定的多，一般为174秒。

③环境条件:

与大多数蛋白一样，荧光标签受pH、温度和氧气浓度的影响。根据所使用的环境，可能需要对条件做轻微调整或选择更合适的标签。

pH值会影响激发峰和发射峰，并且大多数荧光标签对酸敏感，有些标签甚至会在pH值发生变化时改变荧光强度(例如pHTomato)。pKa值是pH灵敏度的良好指标，因为它显示了一半发色团出现荧光时的pH值。

此外，温度和氧气浓度都会影响Maturation时间,低氧条件会导Maturation时间变长，超出荧光标签最佳范围的温度也会延迟Maturation时间(例如EGFP已优化为在37℃下工作)。但是，新型荧光标签(如UnaG，一种从日本淡水鳗鱼(Anguilla japonica)中分离出的GFP)，即使在氧气浓度较低时也会发出荧光。

④密码子优化:

由于大多数荧光标签来源于水母或珊瑚蛋白，可将其用于哺乳动物的细胞和组织，所以使用的氨基酸密码子可能存在种间差异，这会导致表达不佳，因此信号较低。然而许多新版荧光标签已经经过密码子优化，可以满足哺乳动物细胞的密码子偏好。以GFP为例，Jürgen Haas等通过优化GFP密码子序列，将信号增强了40-120倍。

⑤寡聚化:

在使用荧光标签使需确定该标签是单体还是二聚体(单体通常用蛋白名称加“m”前缀表示，例如mCherry)以及是否会对实验造成影响。许多早期荧光标签容易形成寡聚物，而寡聚化可能会影响融合蛋白的生物学功能。例如，EGFP是一种单体，在足够高的浓度下使用时会形成二聚体，这样会导致亚细胞器变形或破坏FRET等实验。

五、融合标签的检测与应用

融合标签可用于目标蛋白没有特异性抗体的多种应用，如：目标蛋白是一种新型蛋白时。应用技术包括Western Blot、免疫沉淀、ELISA、免疫荧光、免疫电镜、表面等离子共振等，而这些应用都需要使用到标签抗体。

①结构研究:

用于结构研究的技术，如核磁共振（NMR）光谱学、X光晶体学和低温电子显微镜，需要优质纯蛋白进行分析。这意味着依靠洗涤剂或还原剂的纯化方法可能不适用，因为这些方法可能会妨碍优质晶体的形成或者影响蛋白结构。

将融合标签连接到您的目标蛋白上，就可以通过提升产率、增加溶解度以及给靶点提供已知表位的方法来提高分离靶点的能力。结构研究的缺点是：融合标签可能会阻止有序晶体形成，并且对于NMR研究来说太大。从蛋白中切割标签则可以解决这一问题，但这样会增加实验成本。虽然如此，仍有超过75%的纯化结晶蛋白与融合标签连接。一些标签可能比其他标签更适合结构研究，因此务必仔细考虑实验设计。

②功能活性试验:

纯化后产生具有功能活性的蛋白对某些研究而言至关重要，尤其是一些潜在疗法的研究。功能研究的一个主要方面是保留正确的信号域和准确的蛋白质折叠，因此小标签可能是首选，因为小标签不太可能影响蛋白质功能。此外，标签的位置对这些研究也很关键，因为位置不正确会降低正确结构的表达量。如果蛋白的结构是已知的，则有助于确定最佳位置。

③定位和动态:

表位和荧光标签都是评估目标蛋白定位的重要工具。免疫荧光显微镜是最常见的可视化技术，既可以直接通过荧光标签实现，也可以间接通过免疫检测实现。还可以用于发现蛋白的哪些区域有助于定位。可以对细胞先分级，然后进行分析，以确定融合蛋白，从而帮助确定蛋白在特定亚细胞区室的定位。由于荧光标签无毒，因此可用于观察活细胞中蛋白的运动。

④表达:

如果想把某一基因导入某一细胞，可以用融合标签来保证该基因的表达。也可以使用相同或不同的标签评估两个基因的共表达。

融合标签还用于在原核系统中表达真核蛋白。该技术通常用于获得高质量的目标蛋白，以便开展后续研究。以这种方式分离真核蛋白面临的挑战之一是：20-40%的真核蛋白不能在原核系统中以可溶形式表达。融合标签(如GST或MBP）可以通过增加目标蛋白的溶解度来帮助克服这一障碍。

六、蛋白纯化和蛋白间相互作用:

蛋白纯化分为四个基本步骤：

1.细胞裂解

2.目标蛋白与基质结合

3.洗去多余的杂蛋白

4.蛋白洗脱

亲和层析、免疫沉淀(IP)和蛋白复合体免疫沉淀(co-IP)是最常见的蛋白纯化技术。尽管这些方法都采用了上述四个步骤，但每种技术使用的固定基质不同。

亲和层析常使用色谱柱作为固定相，并利用氢键或离子键等分子特性。首先让粗裂解液流经色谱柱，使目标蛋白结合，然后洗去非特异性结合的杂质，然后加入洗脱液，从色谱柱中洗脱目标蛋白。

IP的固定相为目标蛋白的抗体。将细胞裂解液与固定相一同孵育，促使抗体与溶液中的蛋白结合。然后使用蛋白A/G偶联琼脂糖微球将抗体/抗原复合体从样本中分离，用于后续分析。例如，通过SDS-PAGE进行分离，用于Western Blot分析。

Co-IP也是使用抗体结合已知的靶点，但其目的是将目标蛋白连同其结合的蛋白一起分离。通过这种方式，可以找到新的结合伴侣或蛋白质网络。为全面了解与主要已知蛋白相关的蛋白网络，后续实验通常包括使用其他分离中发现的蛋白作为靶点进行重复co-IP。

虽然找到目标蛋白的最佳标签需要一定的时间，但良好的开端是成功的一半，下表列出了一些广泛使用的标签，并提供了这些标签的分子量比较。