大肠杆菌表达蛋白的基本流程：

将外源基因插入质粒或其他载体，再导入活的宿主细胞，使外源基因高效表达，获得所需的蛋白质。

大肠杆菌诱导表达实验原理：

原核生物绝大多数的基因按功能相关性成簇地排列，且密集于染色体上，共同形成一个转录单位——操纵子，也称基因表达的协同单位。E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、通透酶（permease）和乙酰基转移酶（transacetylase)；此外还有调控基因：操纵序列O（operator）、启动序列P（promoter）；而I(编码Lac阻遏物，Lac repressor)不属于乳糖操纵子。

Lac阻遏物是一种具有4个相同亚基的四级结构蛋白，都有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态，Lac阻遏物（即下图中的阻遏蛋白）能与操纵基因O结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，阻止了转录的路径，从而抑制转录启动。而当有诱导剂（这里指IPTG）存在时，诱导剂可与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象发生变化，导致阻遏物从操纵基因O上解离下来，RNA聚合酶不再受阻碍，启动子P开始发生转录，启动反应开始发生转录。

在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖——即生理上的诱导剂。而在实验中，通常选用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂，IPTG是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

实验试剂：

质粒(干粉)

大肠杆菌感受态细胞(100uL/管)

TE：10mM Tris-HCl ,1mM EDTA， PH=8.0

LB：试管4ml；含抗生素的LB固体平板

抗性：Amp+（100mg/ml）或 Kan+（30mg/ml）或其他抗生素

保种甘油：浓度50% ，体积50ml

IPTG(浓度1M)

1 x PBS

2 x Loading Buffer

电泳缓冲液，染色液，脱色液

ddH2O

实验仪器：

冰箱（4℃）

超低温冰箱（-80℃）

水浴锅（0~100℃）

摇床（15~37℃；250rpm)

培养箱（37℃）

可见分光光度计（测OD600）

离心机（Max>6000rpm)

煮样器（室温~100℃)

电泳仪

实验步骤：

第一天任务：

1.将装有质粒的离心管放入离心机中，离心（5000r/min；1min)

2.向离心后的质粒离心管中加入TE并混匀，使质粒的浓度为80~100ng/uL

3.吸取1μL质粒溶液加入至100uL的大肠杆菌感受态细胞中并轻轻吹打混匀

4.将感受态细胞放入冰浴中，30min

5.取出后立即放入水浴锅中（42℃），热激90s,

6.再次放入冰浴中，2~3min

7.吸取200μL的LB液体华体会体育最新地址 加入到已转化质粒的感受态细胞中

8.放入摇床，37℃，180rpm，培养45min

9.吸取50μL悬液加入至相应抗性的LB固体平板中(可提前将对应抗性的抗性平板放入37℃培养箱中中预热），用涂布棒涂布均匀

10.把平板倒置放入培养箱中，37℃，过夜培养

第二天的任务：

1.每个平板挑取3个单菌落加入至对应抗性的LB（4ml）试管中，编号为A , B, C

2.将试管放入摇床中，37℃，180rpm) 中，培养至OD值约为0.6至0.8(培养时间约3~4h即可达到此浓度)

3.从各试管中分别取700μL菌悬液加入到300μL（C=50%）的保种甘油中，吹打混匀，可先放入-20℃冰箱冻存，然后转入-80℃冰箱冻存

4.向各试管剩余的菌液中分别加入1.65μL的IPTG(浓度1M)

5.根据不同的质粒载体选择合适的表达环境（如果质粒载体为PET或PGEX，则诱导条件为15℃过夜诱导表达或25℃诱导表达6h，也可使用37℃诱导表达3~4h。如果质粒载体为Pcold，则使用15℃过夜诱导表达。

第三天任务：

1.从诱导表达后的试管中分别吸取500μL菌液加入到1.5ml离心管中，(若菌体浓度较低，可多取一些体积），6000rpm，离心5min, 去上清，留沉淀

2.再向各离心管中分别加入500μL的ddH2O,吹打重悬沉淀，放入离心机，6000pm，离心5min, 去上清，留沉淀

3.向各离心管中分别加入50μL的1×PBS和50μL的2×Loading Buffer吹打重悬菌体

4.将离心管放入煮样器，100℃加热5~10min，以使菌体破碎

5.取出离心管，放入离心机中，6000rpm，离心3~5min, 吸取10uL上清液进行SDS-PAGE电泳检测。

6.根据电泳结果，选择表达量高的菌株作为种子库，后续的实验可使用该表达量高的菌种。

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