聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。

PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

在进行PCR反应时，有时候会出现不能扩增出所需要条带或者扩增产物分子大小不对或产量较低的情况，那么针对此问题，我们该如何优化PCR反应体系呢？以下就针对PCR反应中各组分的作用进行详细的介绍。

1，不同模板浓度对结果的影响：

在25uL的PCR反应体系中，用相同的引物、两种不同的模板,对不同模板量进行PCR扩增,发现在模板量<25ng的条件下,扩增产物强度相应减弱,大约到2ng左右时无扩增产物;当模板量在25ng～200ng之间时,扩增产物基本稳定,条带清晰、稳定、分辨率高;当模板量>200ng时,会出现大片段扩增产物的缺失或无扩增产物且点样孔至泳道会出现相应增强的弥散背景。综合考虑,在25uL的PCR反应体系中,模板DNA以25～100ng为最佳。同时模板DNA在200ng以下不影响扩增结果,但为降低TE缓冲液中EDTA对反应体系中Mg2+的不良影响,应该尽量降低DNA模板用量。

2，不同Mg2+浓度对结果的影响

TaqDNA 聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感。过高或过低的Mg2+浓度均会对PCR反应产生抑制效应，因此需要需要对反应中的Mg2+浓度进行优化。当Mg2+浓度为1.0ｍＭ以下时,无PCR扩增产物;Mg2+浓度为1.5～2.5ｍＭ时,随着Mg2+浓度的增加,PCR扩增产物带型基本一致,但以2.0ｍＭ的扩增效果最好。

3，不同引物浓度对PCR结果的影响

设置不同浓度的引物进行PCR扩增,当引物浓度在0.1～0.2μＭ时,扩增结果基本一致;但随着引物浓度的继续增加,开始出现弥散背景增强的趋势,并且有些扩增带发生减弱或缺失，因此，为了保证反应结果的稳定性和特异性,引物浓度以0.2μＭ左右为宜。

4，不同dNTP浓度对PCR结果的影响

采用2种引物分别以4种不同的dNTP浓度(分别为100μＭ、150μＭ、200μＭ、300μＭ）进行PCR反应时发现,,当dNTP浓度在100～200μＭ时,扩增产物丰富、清晰、带浓,扩增片段产率与dNTP浓度呈正相关。综合考虑,以100～200μＭ的dNTP浓度为佳。

5，Taq DNA聚合酶对扩增结果的影响

对于25uL的反应体系，添加5个梯度含量的Taq DNA聚合酶(0.5U、1.0U、1.5U、2.0U、2.5U),结果表明在0.5U～2.5U浓度间均有扩增产物，随着Taq DNA聚合酶含量的增加，扩增产物量呈增多趋势，但随着Taq DNA聚合酶含量增加的同时，弥散背景也相应增强。综合考虑，对于25uL的反应体系，Taq DNA聚合酶浓度以1.0～1.5U结果较好

6，不同退火温度下的扩增效果的影响

在进行PCR反应时,按照优化的PCR反应体系将退火温度分别设置为35℃、40℃、45℃、50℃。结果表明随着退火温度降低,非特异性产物增加,有弥散背景;退火温度升高,特异性相对增加。

7,延伸温度和时间

延伸温度通常为70-75℃,时间取决于PCR产物的长度，延伸的速度一般为100bp/s，1kbp 片段一般1分钟即可。

8，MgCl2与dNTP互相作用及对PCR反应的影响

使用相同的引物和模板DNA比较3种MgCl2浓度与3种dNTP浓度进行两两组合的方式进行9次PCR实验,研究了MgCl2与dNTP的相互作用。结果表明,MgCl2在低浓度时,过量的dNTP对Mg2+的螯合作用明显,表现为降低Mg2+的酶催化作用,PCR扩增产物减少或无扩增产物，而低量的dNTP对Mg2+酶催化作用的抑制作用减少,PCR扩增产物增多。在高浓度MgCl2浓度下,dNTP无抑制作用。在相同Mg2+离子浓度和足量的dNTP时,扩增产物相似。

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