反相色谱层析（reversed-phase chromatography，RPC）是目前液相色谱分离中使用最为广泛的一种模式。由于RPC固相载体的疏水性，它可以根据流动相中被分离物质分子疏水性的不同而发生强弱不同的相互作用，从而使不同分子在反相柱中彼此分离。早在20世纪50年代，RPC就已应用于许多有机小分子的分析和分离，80年代后逐步应用于生物大分子如蛋白质、多肽、核酸的鉴定，并用于制备规模的分离。

原理：反相层析利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差异进行分离纯化的层析技术。反相层析属于分配层析，溶质在固定相和流动相之间的分配系数取决于溶质的疏水性。溶质的疏水性越大，其在固定相中的分配系数越大；烃类化合物的分配系数与其分子所含碳原子数成正比。当固定相一定时，可通过调节流动相的组成来调整溶质的分配系数。流动相的极性越大，溶质的分配系数越大，因此，RPC多采用降低流动相极性的方式进行线性梯度洗脱。

RPC与其他色谱方法相比具有分辨率和回收率高、重复性好、操作简便等优势。由于RPC可使用挥发性体系如水溶三氟乙酸（TFA）、乙腈（ACN）等，纯化产物不必进行脱盐，因此大大简化了操作步骤。另外，在其他模式的色谱中，保留时间主要决定于天然蛋白质分子表面的某些基团与固定相配基间的相互作用。而在RPC中，蛋白质分子通过色谱柱时会发生或多或少的去折叠，内部某些疏水残基暴露并与固定相相互作用，从而表现出与其他色谱及电泳方法不同的选择性，提供其他方法不能提供的信息，这成为RPC在蛋白质及多肽分离分析中的又一有利因素。因此，RPC已成为目前广泛使用的一种分离模式，普遍用于多肽和蛋白质的分离分析。在多肽及蛋白质的RPC中，初始洗脱条件下洗脱液中有机成分浓度较低，分子与固定相疏水作用较强，几乎完全被固定相吸附。而一旦洗脱液中有机成分达到特定浓度，使得多肽或蛋白质与固定相间作用小于流动相与固定相间的作用时，分子完全从固定相上洗脱下来，几乎不再与固定相发生作用。这一保留机制也被人称为“on-off”机制。正是由于多肽和蛋白质这种特殊的保留机制，洗脱液成分极微小的改变就会大大影响多肽和蛋白质的保留行为，从而保证疏水特征相近的多肽或蛋白质得以充分分离。

RPC主要用于相对分子量低于5000，贴别时1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析与纯化。由于反相介质表面为强烈的疏水性，并且流动相为低极性的有机溶剂，生物大分子在RPC过程中容易变性失活，因此，以回收生物活性蛋白为目的时，应注意选择适宜的反相介质和流动相。

随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值，但需要注意的是，C8和C18使用的pH通常为2.5至7.5，太高的pH会使硅胶溶解，太低的pH会使键合的烷基脱落。

反相层析和疏水层析的比较：

相同之处：均是利用不同物质与固定相之间的疏水性作用力不同进行色谱分离。

不同之处：固定相的疏水程度不同，反相层析介质的表面比疏水层析介质更加的疏水，这导致更强的人疏水作用，以至于为了成功洗脱，需要用非极性的有机溶剂如乙腈、甲醇或一处等。

反相介质的种类：

反相介质的商品种类繁多，其中最具有代表性的是以硅胶为载体，通过硅烷化反应在硅胶表面键合非极性分子层。硅烷化反应如下：

其中硅烷化试剂中的R1和R2多为甲基，R基为C4、C8、C18烷基或苯基

此外，高分子聚合物也可作为反相介质，如聚丙烯酸酯-C18

反相层析的影响因素：

在反相介质已经确定的情况下，影响反相层析分辨率的因素主要包括：流动相的组成，洗脱模式，层析柱尺寸，流速，温度等。

①流动相：流动相中的有机溶剂可降低流动相的极性，流动相极性越低，其洗脱能力越强，因此洗脱时通常采用的有机溶剂比例会逐渐提高，时个样品组分按疏水性由弱到强的顺序洗脱。流动相中对有机溶剂的要求：与水互溶，由较低的紫外吸收及较低的粘度，如乙腈，甲醇，乙醇等。流动相的pH值：反相层析的流动相条件多在低pH值下进行(如pH2~4)，其主要原因时，层析介质在高pH值时不稳定，很多组分在低pH值下具有较好的溶解性，低pH抑制了样品组分中酸性基团及硅胶上硅醇基的解离，因此为了使流动相保持在低pH下，流动相中长加入三氟乙酸(TFA)等。

②洗脱模式：由于溶质中不同组分的疏水性强弱不同，与固定相结合的牢固程度不同，在起始条件下，极性很强的组分不能结合在固定相上面直接被洗脱，其余组分结合在固定相表面，为了将这些组分洗脱下来，必须降低流动相的极性，基增加流动相中的有机溶剂的比例，因此，反相层析的洗脱过程中流动相的组成随时间而变化，通常可以采用线性洗脱或者分步洗脱。较为理想的洗脱条件需多次实验优化后才能得到。

③层析柱的尺寸：主要有内径和柱长决定。内径影响层析柱的规模，对分辨率没有影响；柱长对分辨率的影响与溶质的种类有关，对于小分子有机物，增加柱长可以提高柱效改善分辨率，而多肽、核算等生物大分子对柱长的敏感程度较低。

④流速：流速对于反相层析的影响时多方面的，一般而言，流速对小分子的分离影响较大，而对大分子的分离影响较小。通常高的流速为导致涡流扩散严重，影响样品在固定相和流动相之间的平衡，导致洗脱峰宽度变大，分辨率下降。但过低的流速会导致样品组分纵向扩散加剧，也会使分辨率下降，且分离时间较长，不利于样品的稳定和较大规模的分离。

⑤温度：对反相层析的分离结果具有较大的影响，提高温度能够降低流动相的粘度，增加传质速度，减少区带变宽现象，从而改善分辨率。但是在分离生物大分子时必须考虑到分子的稳定性，不宜使用太高的温度。

反相色谱层析流程图：

使用反相色谱层析时的注意事项：

目前绝大多数RPC分离蛋白质采用的是硅烷化基质为固相填料, 以水-有机溶剂作为流动相, 由于蛋白质具有很大的结构差异性, 天然三维结酶的蛋白质对溶剂化作用的微环境改变是非常敏感的。因此, 有时会使得层析过程变得很复杂。此外, 盐类物质解离引起的离子强度的增大及环境pH的不适均会导致蛋白质失去生物活性, 因此用RPC分离蛋白质时需要一些特殊的要求：

如果当被分离的物质需保留其生物活性时, 要特别注意固定相的特性和流动相的组成变化对其活性的影响, 须在分离试验前研究流动相组成对被分离物质生物活性的影响, 以选择最佳流动相组成。这是很重要的。

所选择的固定相——硅胶的孔径要能适合蛋白质在此固定相上产生多方位的吸附, 特别是分离大分子蛋白时, 如果硅胶孔径不合适, 蛋白质分子不能自由扩散通过硅胶细孔, 则会造成回收率的下降, 此外还须考虑蛋白质分子与硅烷基硅胶的相互作用也导致其对流动相组成的变化的敏感性增高。

必须在确定所需分离的蛋白质分子在层析柱上的保留行为，只用洗脱剂中的一种成分来调节时，才能进行分离，否则如果该蛋白质的保留行为受多种物质的影响则会出现不正常的洗脱峰及发生分子排阻现象。

未经允许不得转载：hth网页入口»蛋白纯化系列十五：反相层析