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凝胶过滤层析（gelchromatography）又称为分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析等。凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。凝胶过滤层析属于非吸附层析，在纯化过程中不会对蛋白性质造成影响，样品可以始终处在稳定的缓冲液中进行纯化。
原理：不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同，凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离。

凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的空隙，随着流动相流动，因此流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱；反之，相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断往复的的进入和流出，流经的路程较长，移动速率慢而最后流出层析柱。而中等大小的分子，它们部分进入凝胶颗粒中，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。

常用凝胶的种类及性质：

凝胶层析法常用的凝胶有天然凝胶（如琼脂粉凝胶）和人工合成凝胶（如葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）。

1）葡聚糖凝胶

葡聚糖凝胶（Sephadex）具有良好的化学稳定性，在1959年由GE Healthcare公司研发，是目前生化产品制备中最常用的凝胶。葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大。G类葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一种以右旋葡萄糖为残基的多糖，分子间主要是α-1,6-糖苷键（约占95%），分支为1,3-糖苷键（约占5%），以1-氯-2,3-环氧丙烷为交联剂将链状结构连接为三维空间的网状结构的高分子化合物。G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也代表持水量（吸水量）。X数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。X数字也代表凝胶的持水量，如G-25表示1g干胶可吸水2.5ml，G-100表示1g干胶吸水10ml。
2）琼脂糖凝胶

琼脂糖凝胶（agarose gel）由于其孔径较大，可以分离葡聚糖凝胶所不能分离的大分子，使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达相对分子质量108 。最初的琼脂糖凝胶由琼脂制备，但是由于琼脂有强烈的吸附作用，给该填料的使用造成了困难，后来，经过科学家的研究，从琼脂中分离出两个组分，一个组分为带负电荷的琼脂果胶，含有磺酸基和羧基；另一组分叫琼脂糖，它不含有带电基团，其结构是由β-D-吡喃半乳糖和3,6脱水-L-吡喃半乳糖相结合的链状多糖。这种不带电荷的琼脂糖被用来制造凝胶层析填料，它既具有与琼脂凝胶相同的分离区间，又大大降低了吸附作用。然而其稳定性远不如葡聚糖凝胶，强酸强碱能引起结构破坏，导致其使用条件需控制在pH4-9之间，温度控制在0-40℃，超出此范围，可能被破坏。琼脂糖凝胶做成珠状后不可以进行脱水干燥，否则不能再溶胀恢复原有的形状，因此商品大都以含水状态供应和保存。
3）聚丙烯酰胺凝胶

聚丙烯酰胺凝胶也是一种人工合成凝胶，其商品名为生物凝胶P（Bio-gel-P），和交联葡聚糖一样，为颗粒状干粉，在溶剂中能自动吸水溶胀成凝胶。其由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺通过自由基引发聚合形成聚丙烯酰胺凝胶。只要控制单体用量和交联剂的比例，就能得到不同型号的凝胶。在聚丙烯酰胺凝胶的合成过程中，单体和交联剂的配比可以任意改变。以（T）代表100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数，称为凝胶浓度。而其中交联剂占单体和交联剂总量的百分比称为交联度，以（C）表示，交联度越大，网孔越小，交联度越小，则网孔越大。聚丙烯酰胺凝胶全是由碳-碳骨架构成，稳定性较好，适合于做凝胶层析的载体。只有在极端pH条件下酰胺键才能被水解为羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团，故一般只在pH2-11的范围内使用。根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表示，从Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300。P后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）。
凝胶层析常用参数：

外水体积: 柱内凝胶颗粒之间的空隙体积的总和，用V0表示。
基质体积:凝胶颗粒本身所固有的体积，用Vs表示。
内水体积:凝胶颗粒内部孔隙体积的总和，用Vi表示。
柱体积:凝胶柱装成后从柱底板到凝胶沉积层表面的总体积，又称床体积，用Vt表示。

凝胶过滤层析的分辨率(用Rs表示)：两个洗脱峰峰顶对应的洗脱体积之差比上两峰在基线上峰宽和的平均值。

影响分辨率的因素：样品体积和柱体积的比值，流速，柱子直径，填料颗粒大小，填料颗粒大小分布，填料颗粒的孔径，装柱密度，流动相的粘度。
※粒径减小，有利于提高分辨率，但是反压会增加，流速需降低，层析时间延长
※装柱柱床和粒径的均一性影响过柱子的液流的均一性，影响峰形和峰宽
柱效：已装柱子的柱效决定了它在洗脱过程中产生狭窄对称峰的能力。由于凝胶过滤分离时，只有一个柱体积的缓冲液流过柱子，因此柱效非常重要。

凝胶过滤分离蛋白质的过程：
（1）选择合适的凝胶填料并装柱；
需根据实验目的(高分辨率、组群分离)；将要分离的目标蛋白和杂质的分子量范围；纯化规模。superdex-高分辨率，短运行时间，高回收率；superose-广泛的组分分离范围，不适合大规模纯化；sephacryl-适合实验室和工业级高流速，高回收率分离。
（2）蛋白质样品上柱；
对于群组分离，可以使用高达总柱体积的30%的样品体积进行上样。对于高分辨率组分分离，推荐上样量为柱体积的0.1%~5%,不同比例取决于柱子的类型。对于大多数应用来说，为了获得最大的分辨率，样品体积一般不超过柱体积的2%。对于分析分离和复杂样品分离，上样的样品体积选择柱体积的0.5%即可，因为上样量低于柱体积0.5%通常不能继续提高分辨率。为了增加凝胶过滤的分辨率，可以将样品进行浓缩，但蛋白浓度不应超过70mg/ml，因为粘度效应会干扰分离效果。
（3）开始洗脱，小分子进入凝胶颗粒内，大分子被排阻在颗粒外；
为了获得分离，使用适当的流速，确保有足够的时间允许分子可以弥散进入或流出柱料。分离的目的是在尽可能短的时间获得最高可能的分辨率，因此必须对流速进行优化，以期获得两个参数的最佳平衡。
高分辨率--使用长的柱子(柱高增加一倍，分辨率增加~40%)和低的流速
快速分离--使用的短的柱子和高的流速
（4）分子量小的蛋白被滞留其移动速度较慢，大分子移动快，大小不同的分子开始分离；
（5）随着时间的延长，大小不同的分子完全分开；
（6）大分子已被洗脱，而小分子仍在层析柱内。

凝胶层析规模放大：

层析柱的维护：

凝胶过滤层析使用一段时间后，可能会积累一些沉淀蛋白或其他杂质，如层析柱上层出现变色，上部的接头和填料最上层有空隙，分辨率丢失，反压增加等，因此需要对填料进行清洗。每种填料的清洗方法需参考各种填料的说明书，尽量使用说明书推荐的方式。
预防比后处理更重要！！！
1，样品上样前均进行过滤处理，去除沉淀蛋白
2，缓冲液须过滤并进行脱气处理，避免运行过程中产生气泡
3，缓冲液，样品，层析柱保持在相同的温度
4，下次分离前用2~3倍柱体积的缓冲液重新平衡柱子

常见问题解析：

①.出峰对称性差

出峰上升时，上升缓慢是填料装填过紧，而拖尾是因为装填的太松，此时对称因子及柱效都很差，出现这种情况就要重新装柱。

②.柱床出现干涸或裂缝等塌柱现象

检测管路及柱床体系是否有泄露或气泡，检测流动相是否进行脱气处理，必要时重新装柱。

③.分离度差

※样品和选择的填料不匹配

待分离的样品中目标物质和其它杂质的分子量相差小于2倍并且都在选择填料的排阻极限之外或者之内。如样品中目标物质的分子量与杂质的分子量相差小于2倍时，建议尝试其它方法分离，反之选择凝胶过滤层析时，填料的选择应根据样品中目标分子的大小选择最接近（大或小都可以）目标分子排阻极限的填料进行分离。

※装柱效果不好，柱效很差

根据厂家建议的方式进行装柱，多做尝试，积累经验。

※上样量过大

根据样品中目标物质和杂质的分子差异优化上样量，如脱盐等样品中目标分子和杂质的分子量大于50倍时，上样量可以达到柱床体积的25%，最高不超过30%，若样品中目标分子和杂质的分子量差异在2-5倍时，通常上样量控制在柱床体积的5%以内。