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文章导读：

转甲状腺素淀粉样变性（ATTR, Transthyretin amyloidosis）是一种危及生命的疾病，通常是由于转甲状腺素蛋白（TTR）导致，其特征是错误折叠的TTR蛋白在神经和心脏等组织中发生沉积。TTR是ATTR的关键靶点，对TTR基因或蛋白进行纠正可治疗ATTR。

2021年6月，Intellia公司公布了NTLA-2001治疗ATTR的阳性结果，全文发表在顶级医学期刊《新英格兰杂志》(NEJM)。NTLA-2001是一款体内基因编辑疗法，使用LNP将Cas9 mRNA和向导RNA递送至人体，在体内完成TTR基因的特异性敲除。Intellia公司聚焦于mRNA介导的CRISPR/Cas基因编辑技术，尝试通过基因编辑的策略治疗遗传性疾病。

2022年11月，Intellia公司公布的第二款体内CRISPR 基因编辑疗法——NTLA-2002也取得积极结果，再次验证了Cas9 mRNA体内编辑疗法的安全性和疗效。基于Cas9 mRNA体内编辑技术的又一突破性进展，本文介绍了CRISPR/Cas体内基因编辑疗法NTLA-2001和NTLA-2002的临床结果，随后对发表于《新英格兰杂志》的CRISPR/Cas体内基因编辑疗法——NTLA-2001治疗ATTR的临床结果进行了详细解读，包括NTLA-2001的设计思路、作用机制和临床疗效，以供参考。

一、Intellia公司CRISPR/Cas体内基因编辑的最新进展

上篇文章中，我们了解到CRISPR/Cas系统常见的三种应用模式，包括质粒DNA介导的基因编辑、mRNA介导的基因编辑和Cas-RNP介导的基因编辑：CRISPR/Cas基因编辑的利器：质粒DNA、mRNA or Cas蛋白？作为CRISPR领头公司之一的Intellia，专注于mRNA介导的CRISPR/Cas基因编辑技术，除体外基因编辑外，Intellia同时尝试了借助脂质纳米颗粒（LNP, Lipid Nanoparticle），将编码Cas9蛋白的mRNA与gRNA递送至人体内，在人体内完成CRISPR/Cas基因编辑，并基于此布局了多条体内基因编辑管线，包括治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）的NTLA-2001、治疗遗传性血管水肿（HAE）的NTLA-2002。NTLA-2001和NTLA-2002均已进入临床阶段，并取得阶段性成果。

2022年11月，Intellia公司在美国免疫年会上公布了NTLA-2002的首个人体试验结果，这是Intellia公司公布的第二款体内 CRISPR 基因编辑疗法。NTLA-2002是一种体内基因编辑疗法，使用LNP包封sgRNA和Cas9 mRNA将其递送至人体，NTLA-2002在人体内编码Cas9蛋白，与sgRNA形成Cas9-sgRNA复合物（RNP），在sgRNA向导下精准地敲除激肽释放酶B1（KLKB1）基因，用以治疗遗传性血管水肿（HAE）。中期研究结果显示，安全性方面，在评估的三种剂量水平下（25mg, 50mg, 75mg），NTLA-2002具有良好的耐受性，没有观察到严重不良事件。疗效方面，NTLA-2002导致患者血浆激肽释放酶快速且大幅下降，降幅达64%以上；已有数据显示，5-16周的随访期间HAE发作频率下降约89%，显示了NTLA-2002的良好疗效和安全性。

图1 Cas9 mRNA体内基因编辑的潜在机制

NTLA-2001是Intellia公司公布的第一款体内 CRISPR 基因编辑疗法，与再生元（Regeneron）联合开发，也是一款Cas9 mRNA介导的体内基因编辑疗法，经LNP递送至人体肝脏，特异性敲除人转甲状腺素蛋白（TTR）基因，适应症为转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）。NTLA-2001的I期中期数据显示了积极结果，并于2021年6月份发表在顶级医学期刊《新英格兰杂志》（NEJM）。下文菌菌将对该文章进行详细解读，涉及NTLA-2001的设计思路、作用机制和临床疗效。

二、 NTLA-2001的设计思路

为满足Cas9体内基因编辑的基本元件，作者设计了Cas9 mRNA序列和sgRNA序列。作者选择了化脓性链球菌（Spy, Streptococcus pyogenes）来源的Cas9 mRNA，由约4400个核苷酸组成，并针对人密码子偏向性进行了密码子优化。sgRNA的末端包含TTR基因互补序列，以实现TTR基因特异性，sgRNA分子大小约35 kDa。

为将Cas9 mRNA和sgRNA成功递送至人体，作者选择了非病毒载体的方法，使用LNP包封Cas9 mRNA和sgRNA，特异性靶向肝脏组织。LNP成分包括可电离脂质、磷脂、聚乙二醇脂质和胆固醇。

当前mRNA体外转录、加帽加尾、核苷酸修饰和递送系统的发展，逐步解决了mRNA稳定性、翻译效率、免疫原性等挑战。研究人员通常合成携带5’ Cap和poly(A)尾的Cas9 mRNA，增强mRNA在细胞质内的稳定性，确保有效的mRNA翻译。其次，外源性mRNA可被Toll样受体（TLRs, Toll-like receptors）识别，引发中重度免疫反应，为避免以上免疫原性，可在mRNA合成过程中耗尽尿苷或掺入假尿苷。也有研究表明，对sgRNA进行化学修饰可提高其稳定性、降低免疫原性。

与质粒DNA介导的体内编辑技术相比，mRNA在细胞中的转换速度更快，限制了蛋白质的持久性，从而减少了潜在的脱靶效应。为快速推进mRNA介导的基因编辑研发进程，耀海生物推出科研级别Cas9 mRNA预制品，纯度、完整性和加帽率等指标均达到业内一级水平，高质量满足客户下游实验需求。

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图2 NTLA-2001的设计思路

三、NTLA-2001的作用机制

转甲状腺素蛋白（TTR）主要产生于肝脏，正常的生理条件下TTR是一种高度稳定的四聚体蛋白，而TTR基因突变会导致TTR的四聚体结构不稳定，促使TTR分解为单体，TTR单体在外周神经系统、心脏、眼、肾脏、脑膜等组织发生病理性聚集，形成不溶性淀粉样沉积。细胞内的淀粉样异常沉积会造成细胞本身新陈代谢异常，导致整个组织功能上的改变和紊乱，从而引发相关的疾病，例如遗传性转甲状腺素淀粉样变性（ATTR），而转甲状腺素蛋白（TTR）是ATTR疾病的一个重要靶点。

LNP递送系统的肝脏靶向性有利于NTLA-2001疗效的提高，同时可最大化降低全身毒性作用。NTLA-2001经静脉给药并进入血液循环后，LNP首先经血浆载脂蛋白E（ApoE）的调理作用，通过循环系统运送至靶向部位肝脏。具体方式如下：NTLA-2001 LNP转运到肝内的肝窦毛细血管，被肝细胞表面表达的低密度脂蛋白（LDL）受体摄取，随后通过胞吞形成内吞体。然后LNP分解并将有效成分（TTR特异性sgRNA和Cas9 mRNA）释放至细胞质，完成其递送过程。

Cas9 mRNA通过核糖体进行蛋白质的翻译，生成Cas9核酸内切酶，也称Cas9蛋白。sgRNA与Cas9蛋白相互作用，形成RNP复合物。具体转运方式如下：RNP通过入核转运的方式进入细胞核，并识别TTR基因中非互补DNA链的前间隔序列邻近基序（PAM, protospacer-adjacent motif）。sgRNA 5’端的TTR基因特异性序列在特异位点与DNA双螺旋结合，诱导染色体DNA解旋，然后与靶基因结合。Cas9经过一系列构象变化和核酸酶结构域激活，精确靶向由sgRNA互补序列导向的TTR序列，促使DNA切割。切口末端在内源性DNA修复机制下完成连接，这一过程可能导致碱基插入或缺失（indel）。由于错义或无义突变减少全长mRNA的数量，因此基因的插入或缺失可能降低功能性靶基因的mRNA水平，进而导致目标蛋白水平降低，由此实现CRISPR基因敲除的效果。

图3 NTLA-2001的作用机制

四、NTLA-2001的临床疗效

这项I期试验纳入了6例患者，接受NTLA-2001单次静脉给药，总RNA剂量为0.1 mg/kg体重或0.3 mg/kg体重。为评估NTLA-2001的药效学作用，研究者在I期试验中评估了受试者的血清TTR浓度。结果显示，在14天时观察到血清TTR蛋白浓度相对基线显著降低，且至第28天时进一步降低。基线至28天时，NTLA-2001 两个剂量组患者的TTR水平降幅达47%-96%，且具有剂量依赖性，0.3 mg/kg体重的大剂量下，患者血浆TTR水平降幅更大。

图4 NTLA-2001的临床疗效：TTR水平降幅

五、展望

如上所示，基于CRISPR/Cas的体内基因编辑疗法——NTLA-2001，其I期临床试验的中期数据得到了阳性结果，NTLA-2001可显著降低ATTR患者的血浆TTR水平，然而其安全性和疗效数据仍需长期随访及更多的患者数据来验证。

CRISPR/Cas9体内基因编辑疗法的方法是平台化的，研究人员可构建通用的Cas9 mRNA，通过特异性设计或改造sgRNA以应用于多种适应症。作用机制方向，NTLA-2001、NTLA-2002等基因编辑技术可以实现基因敲除，以下调对人体有害的、致病性的蛋白产物；Intellia公司同时也在尝试将CRISPR/Cas9技术应用于基因插入，应用于突变导致的功能缺失，从而产生正常功能的蛋白。由此可见，CRISPR/Cas9基因编辑疗法未来可期！

为助力CRISPR/Cas基因编辑项目的有效落地，耀海生物身为细胞与基因治疗领域（CGT）的CDMO上游服务商，可提供科研级mRNA样品、GMP级质粒、GMP级Cas9蛋白生产服务，高质量满足下游科研或临床需求。

参考文献：

[1] Gillmore JD, Gane E, Taubel J, et al. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. N Engl J Med. 2021 Aug 5;385(6):493-502. doi: 10.1056/NEJMoa2107454.

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[5] Intellia Therapeutics. Intellia and Regeneron Present Updated Interim Data from Phase 1 Study of CRISPR-based NTLA-2001 for the Treatment of Transthyretin (ATTR) Amyloidosis Demonstrating that Deep Serum TTR Reductions Remained Durable After a Single Dose.

[6] Intellia Therapeutics. Intellia Therapeutics Presents New Interim Data from First-in-Human Study of NTLA-2002 for the Treatment of Hereditary Angioedema (HAE) at the American College of Allergy, Asthma & Immunology 2022 Annual Scientific Meeting.

[7] Intellia Therapeutics. In vivo CRISPR CAS9 editing of KLKB1 in patients with HAE. ACAAI Abstract. 2022 Nov 12 Vf.

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