1,根据抗体基因的不同来源，基因工程抗体可分为嵌合抗体、改型抗体、全人源化抗体等。嵌合抗体基因通常由鼠源可变区基因和人源恒定区基因拼接而成，保留高特异性和亲和力的同时大大降低了异源抗体引起的不良反应。改型抗体是将鼠源互补决定区基因接入人抗体骨架得到的抗体，可基本消除免疫原性。全人源化抗体的基因全部来自人抗体基因。

2,根据抗体结构，基因工程抗体包括抗原结合片段(Fragment antigen-binding，Fab)、单链抗体(Single-chain variable fragment，scFv)、单域抗体(Single-domain antibody，sd Ab)。Fab是抗体上与抗原结合的区域，包含轻链可变区(VL)、恒定区(CL)和重链可变区(VH)、CH1区。与Ig(约155kDa)相比，Fab体积小，易于在细菌系统中表达，组织穿透能力强。与其他重组抗体相比，Fab免疫原性低、亲和力高，近几年广泛应用于预防、诊断、治疗等领域。scFv是VH与VL的融合蛋白，连接肽通常富含甘氨酸以提高柔韧性，可将VH的N端(或C端)与VL的C 端(或N端)相连。虽然去除了C区并加入连接肽，但scFv仍然保留了原免疫球蛋白的特异性。sdAb也称纳米抗体，它的发现基于骆驼和鲨鱼体内天然缺失轻链的重链抗体。sdAb是已知最小的功能性抗原结合片段，大小仅14kDa，结构简单，易于在细菌和酵母中表达，特别适合基因工程方法。sdAb可溶性好，稳定性高，可用于探索抗原受体起源、研发疫苗、治疗药物、诊断试剂和生物技术研究工具等。scFv是最常用的抗体类型，可能是因为考虑到抗体与小分子的结合效率。虽然sdAb可单独识别小分子，但亲和力往往不够理想。scFv是满足VH和VL同时存在的最小的抗体片段。虽然Fab也有VH和VL，但两个C区和中间的铰链区使其分子体积比scFv大了一倍多。且C区不参与小分子的识别与结合，其主要功能是维持抗体分子的稳定，所以单从亲和力角度考虑，Fab 与scFv相比没有特别的优势，反而双倍的体积会在构建抗体文库和淘选过程中带来不便。虽然缺失C区而易于多聚化一直是scFv 的不足，但通过开发双特异性抗体可以克服这个缺点。

抗体库技术是制备基因工程抗体的主要方法，分为构建和筛选两个过程。构建抗体库是在DNA水平上获得抗体可变区基因并克隆到载体中，在展示系统中表达抗体以便通过淘选富集阳性克隆，最后利用抗原筛选出携带特异性抗体基因的克隆，进行鉴定与分析。不同的展示系统其原理不尽相同，在构建和筛选抗体库的方法上也有所差别，各具优势。

①抗体库构建：根据抗体基因的来源可将抗体库分为天然库、合成库和免疫库。天然库的V基因来自未免疫个体的抗体基因。构建高度多样性的天然抗体库需要花费大量精力，但构建成功后可以反复使用，针对多种抗原进行筛选。然而，由于抗体基因来自人或动物免疫系统，所以无法保证通过筛选获得的克隆能在细菌中表达。此外，天然库筛出的抗体常常会引起宿主菌的不良表达或对其产生毒性，这些问题可以通过合成抗体库来解决。天然抗体库一般不适合在没有载体分子的情况下分离识别小分子的抗体。合成库不受天然免疫系统的限制，因此更有可能包含目的抗体。全合成库是通过克隆生殖系DNA抗体基因序列构建的。VH、D、J或Vκ/λ、Jκ/λ基因片段在体外进行排列组合，重组成完整的VH和VL基因。随后将合成库克隆到表达载体中，可生成10^7~10^10的文库。已有研究从合成库中分离出蛋白和半抗原的特异性抗体，但亲和力一般不高。免疫库是为代替杂交瘤而最先被开发出的抗体库，具有库容小但特异性和亲和力高的特点。通常将小分子与载体蛋白偶联后对动物进行注射免疫，动物体内对此抗原产生高水平的抗体，在总抗体mRNA中高度表达对应的抗体

mRNA。因此，即使来自免疫供体的抗体文库库容只有10^5，也能产生特异性抗体，并且由于抗体基因在体内已经经历了亲和力成熟，所以不需要进一步提高亲和力。免疫库已被用于筛选病毒表面抗原、细菌霉素、细胞表面肿瘤抗原的特异性抗体,其KD值低至10^-10mol/L。在构建免疫抗体库时，用多种抗原免疫单只动物可同时获得多种特异性高亲和力抗体。

②抗体库筛选：基因工程抗体的体外分离取决于筛选大型抗体基因组合文库以分离出与靶分子特异性结合的克隆的能力。大多数免疫技术应用都需要筛选 10^5~10^11 大小的抗体库，所以必须开发出高效、高通量的筛选技术。过去30年来，各种技术的复杂性和灵敏度不断提高，已从大量抗体库中分离高亲和力抗体。展示技术是目前筛选抗体库的主流方法，其中使用最广泛的是基于丝状噬菌体表面的抗体展示。将抗体基因与外壳蛋白基因连接并融合表达，使抗体蛋白成为噬菌体外壳蛋白的一部分，阳性克隆与固定抗原结合，其他噬菌体被洗去，洗脱后再重复该过程，以达到富集的目的。3~6轮后感染合适的细菌，以便收集噬菌粒，获得DNA序列并测序，以鉴定具有亲和性的抗体。噬菌体展示可直接得到抗体基因并高选择性地筛选抗体，但易受转化效率限制。也可在微生物细胞表面展示抗体，如大肠杆菌和酿酒酵母。以大肠杆菌为例，将抗体基因插入大肠杆菌外膜蛋白基因，使抗体蛋白进入重组细胞外表面并展示在外膜蛋白上，但不能展示过大的蛋白。抗体库的每个细胞展示不同抗体的多个拷贝，将抗体库与荧光标记的抗原共孵育以达到筛选目的。能与抗原结合的细胞被荧光标记，通过荧光激活细胞分选（Fluorescence⁃activated cell sorting，FACS）分离。核糖体展示需要核糖体、mRNA和抗体形成三元复合物，通过加工修饰DNA，使核糖体翻译到mRNA末端时缺乏终止密码子而不脱离，形成三元复合物。复合物的mRNA被反转录，产生编码抗体的DNA，抗体负责与固定化抗原结合。然后DNA被 RNA聚合酶转录，开始另一个形成和筛选三元复合物的循环。也可以直接通过活性氨基酸类似物嘌呤霉素形成共价的mRNA⁃抗体复合物，优点是共价mRNA⁃抗体复合物更稳定，可以在严格的筛选条件下富集抗体并增强稳定性。核糖体展示不受细胞转染和表达影响，但操作过程较复杂。不同的淘选策略决定了最终的结果，例如淘选中使用的洗脱方法会影响抗体的结合特性，但有效的策略在实验前是很难预测的。多种方式组合的淘选策略可能比单一的方法效果更好，有研究称噬菌体展示、酵母展示和FACS结合的筛选方法广泛适用于分离可溶性抗原的scfv。抗体库的筛选是抗体工程最重要的工具之一。筛选大容量抗体库的能力使模拟哺乳动物免疫反应的技术得以发展，无需动物免疫即可分离抗体，并改造出具有更高亲和力、稳定性、效应子功

能的抗体。

虽然通过传统免疫方法已获得具有特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，但多抗的功能在不同免疫批次之间可能会有所不同，生产单抗的杂交瘤细胞系也可能不够稳定，其亲和力和特异性远不如基因工程抗体。结合体外展示技术，通过控制筛选条件，基因工程抗体能够识别相关抗原分子间的细微差异，如蛋白质序列和特定的构象，其效果好于通过免疫获得的抗体。尽管抗体库技术还没有完全取代传统方法，但通过体外展示筛选出的基因工程抗体能快速获得抗体序列信息，更好地控制抗体的性质，有利于在基础研究和应用研究中的应用。基因工程抗体还克服了免疫耐受性，可选择识别高度保守的靶标的亲和试剂，对化学或热变性有更高抗性。此外在技术层面，基因工程抗体的体外展示相对简单、廉价、快速，易于自动化以提高筛选效率。