发酵工艺：生产菌种的制备

1.孢子制备

孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。孢子的扩大繁殖可经过斜面华体会体育最新地址生长或谷物固体华体会体育最新地址生长，不同菌种的孢子制备工艺有不同的特点。

1.1.霉菌抱子制备

霉菌孢子的制备一般采用大米、小米、玉米、熬皮、麦粒等天然农产品为华体会体育最新地址，这些农产品中的营养成分适合霉

菌的孢子繁殖，华体会体育最新地址的表面积大，获得孢子数量要比营养琼脂斜面多。而且培养简单易行、成本低。霉菌孢子的制备首先将保存的菌种接种到斜面华体会体育最新地址上，孢子成熟后制成孢子悬浮液接种于大米等华体会体育最新地址中，培养温度25 ~28℃，培养时间一般为4 ~14天，待子成熟后，放置4℃冰箱中保存备用。

1.2.放线菌抱子制备

放线菌的孢子培养多数采用琼脂斜面华体会体育最新地址，华体会体育最新地址中含有适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐类物质等。一般情况下，干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子的形成，放线菌抱子培养温度一般为28℃，培养时间为5~14天。华体会体育最新地址含碳源和氮源不应过于丰富，碳源过多(>1%)容易造成酸性环境，不利于放线菌的子繁殖；氮源过多(>0.5%)有利于菌丝繁殖而不利于抱子形成。如灰色链球菌在葡萄糖、硝酸盐的华体会体育最新地址上能很好地生长和生产孢子，而加入0.5%酵母膏或酪蛋白后就只长菌丝而不长孢子。放线菌发酵生产的工艺流程表示如下：

(1)保存菌种一母斜面(抱子)一子斜面(抱子)-种子罐一发酵罐

(2)保存菌种一母斜面(抱子)一摇瓶菌丝一种子罐一发酵罐

采用哪一种形式的斜面孢子接入种子罐进行培养，视菌种特性而定。采用母斜面孢子有利于防止荣种的变异，而采用子斜面孢子可节省菌种用量。

1.3.细菌抱子制备

细菌的菌种一般保藏在冷冻干燥管内，产芽孢的芽孢杆菌有的也保存在砂土管中。细菌的斜面华体会体育最新地址多采用碳源限量而氨源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有机氨源。细菌的培养温度多数为37℃少数为28℃。培养时间随菌种的不同而异，一般为1~2天，产芽孢的细菌需培养5~10天。

1.4.孢子制备的技术要点

制备霉菌类孢子时，为便于挑选理想的菌落，母斜面上的菌落要求分散。挑单菌落种子斜面时，要挑取菌落中央部位的孢子。斜面制备大米孢子时，孢子悬液的浓度应适当，接种后将大米等固体华体会体育最新地址与孢子悬液混合均匀，待孢子生长成熟后，在真空下将水分含量抽至10%以下，密封后置4℃冰箱中保存备用。放线菌类孢子的制备，灭菌后的华体会体育最新地址如有不溶解的原材料，应轻轻摇匀，注意不要产生气泡，经检查无杂菌和无冷凝水后备用。

2.种子制备

液体种子的制备是将固体华体会体育最新地址上培养出的抱子或菌体转入液体华体会体育最新地址中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。种子制备的目的是为发酵生产提供一定数量和质量的种子。种子制备所使用的华体会体育最新地址和工艺条件，要有利于抱子发芽和菌丝的繁殖。生产种子制备包括摇瓶种子制备和种子罐种子制备。

2.1.摇瓶种子制备

某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐，这种方法获得的液体种子，称作摇瓶种子。摇瓶种子可以在摇瓶中传代，第一代称作“母瓶”，第二代就叫作“子瓶”。母瓶或子瓶都可以作为生产上种子罐的种子。摇瓶种子制备流程如图所示

2.1.1.华体会体育最新地址配制

摇瓶相当于微缩了的种子罐，华体会体育最新地址配方和培养条件都与种子罐相似。华体会体育最新地址成分要求比较丰富和完全，并易被菌体分解利用，氨源丰富有利于菌丝生长，原则上各种营养成分不宜过浓，子瓶华体会体育最新地址浓度比母瓶略高，更接近种子罐的华体会体育最新地址配方。此外，摇瓶种子在培养过程中因不便于调节pH，所以在华体会体育最新地址成分的选择时应考虑培养过程中pH的稳定性，可以通过生理酸、碱性物质的平衡搭配及加入磷酸盐、碳酸钙等缓冲剂来调节。

2.1.2.接种

摇瓶种子的接种方法包括斜面种子挖块法、米孢子粒计数接入法和菌悬液接种法。前两种接种法难以掌握一致的接种量，可能影响种子质量的稳定。因此最好采用菌悬液接种法，向琼脂斜面培养物上加人无菌蒸馏水，将斜面种子或米抱子粒上的细胞或抱子洗下，制成细胞或抱子悬液，用无菌吸管接种至摇瓶种子华体会体育最新地址中。

2.1.3.培养

摇瓶种子在恒温摇床上进行培养。摇床分旋转式和往复式，多采用旋转式。根据菌种不同的生长特性控制其在最适的温度和湿度环境下，同时设定一定的摇床转速，保证摇瓶种子具有较合适的溶解氧。

2.1.4.保存

摇瓶种子最好培养成熟后立即使用，如暂时不用，需放置4℃冰箱环境保存，时间最好小于3 天。经过保存的摇瓶种子一般不用作生产种子，可用于摇瓶发酵实验或小型发酵罐实验。

2.2.种子罐种子制备

种子罐的作用主要是使抱子发芽生长繁殖成菌(丝) 体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体数量和浓度，利于产物的合成。种子罐种子的制备工艺过程因菌种不同而异，一般可分为一级种子、二级种子、三级种子。抱子或者摇瓶菌丝接入体积较小的种子罐中，经过培养后形成大量的菌丝，该种子称为一级种子，把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子:将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵，依此类推，使用三级种子的发酵称为四级发酵。