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01、短期保存

传代保存：许多丝状真菌可通过在合适的介质传代培养来成功维持其特性。然后，使用最佳华体会体育最新地址和生长条件来确保健康细胞保留住其形态和生理特性是非常重要的。在一般情况下，能促进孢子形成的华体会体育最新地址被认为是必须的。如果可能的话，最好是在试管或培养瓶的琼脂斜面上培养真菌。传代应该只在培养物的生长边缘进行，采取预防措施以避免污染。当长期使用相同华体会体育最新地址培养真菌时，可能会导致真菌退化，因此应该经常更换华体会体育最新地址。一种简单的华体会体育最新地址如土豆/胡萝卜琼脂通常可以用于诱导已经恶化的菌株形成孢子。另外，对一些老化的真菌菌株如毛霉菌目(Mucorales)进行连续的孢子传代会导致菌株退化，菌丝体和孢子传代似乎可以降低这种影响。

不同真菌的传代间隔不同，一些需要每2~4周传代次，大多数每2~4个月传代一次，而其他的种类可能存活超过12个月而不需传代。在琼脂上生长的菌株可以储存在室温下。存储在冰箱里或5~8℃可以延长传代周期至4~6个月。然而，也有一些真菌，如嗜热菌，对这些存储温度敏感。

通过连续传代来维持真菌有许多缺点。最值得注意的是污染、变异体的选择、菌株的错误标记、螨虫感染及劳动强度。酵母可以在固体或液体华体会体育最新地址中经连续传代被成功保存。一般来说，许多酵母在固体华体会体育最新地址中能比在液体华体会体育最新地址中存活更长时间，尤其是非发酵酵母。新鲜华体会体育最新地址接种高活性的细胞，在适当的温度下孵化。充分生长后在冷藏温度(4℃)下储存细胞。大多数种类的酵母能保持至少6个月的活性。传代的时间间隔必须由实验决定。不推荐使用连续传代延长菌种维护，因为已经观察到基因突变发生。此外，子囊孢菌株可以在琼脂斜面长期保存过程中形成孢子，导致变异株出现。许多真菌和酵母通过在合适的华体会体育最新地址上干燥来多年保存，如硅胶、土壤、滤纸，也可以通过在真空条件下进行液态干燥(L-干燥)。

① 硅胶

无菌脱水硅胶(6~22目，非指示型)分装到培养瓶中并填充1/4体积，然后在180℃下灭菌2~3h。含有无菌硅胶的瓶子通过放置在含有与硅胶等深的乙烯和干冰的冷却锅中冷却，或将这些瓶子放在水中，在-24~-17°C的机械冷冻机内冷却。真菌孢子悬浮在已经冷却至4°C的含5%脱脂牛奶的无菌溶液中。孢子悬浮液加入到冷却的硅胶中直到 3/4 的硅胶被浸润。避免硅胶饱和很重要。培养瓶冰浴20~30min，然后搅拌以确保悬浮液的彻底分散。瓶子保存在25℃12周直到摇动时晶体易于分离。密封带螺纹盖的接种瓶，并在4℃下将其存放在铺有指示硅胶的密闭容器中。要复苏真菌孢子，应将少量的晶体洒在合适的华体会体育最新地址中并孵育。此法已成功地用于各种真菌。酵母用这种方法保存会发生变异，有些在保存3个月后会失去活性，而其他一些能在2~5年后仍存活。

② 土壤

多种真菌可以一直在土壤中保存。该方法包括接种1mL的孢子悬浮液到已经两次高压灭菌的土壤中，两次灭菌间隔24h，每次在12℃下15min。土壤在室温下培养5~10d，然后保存在4~8℃的冰箱中。通过将少量米粒大小土壤接种到合适华体会体育最新地址中来复苏菌株。

③ 滤纸

酵母可通过在圆形或方形滤纸上干燥并保存在干燥硅胶中来保存。将沃特曼(Whatman)4号滤纸剪成10mm宽的小正方形或圆形，并放置在一个小铝箔上，然后折叠成包并在121℃下高温灭菌15min。无菌的圆形或方形的滤纸通过浸入含有大量酵母的 5%脱脂牛奶悬浮液中接种。小孢在4℃的干燥器中干燥2~3周，然后放在密封容器中并储存在4℃下。通过无菌取出一片滤纸并接种到合适的固体或液体华体会体育最新地址中来复苏菌株。酵母用这种方式可以维持活性超过2~3年。

④ L-干燥

L-干燥是指一种在防止冻结的同时对液体进行干燥的方式。通常在温度不低于5~10℃的真空下发生干燥，Malik对该方法进行了改进和简化，用于容易被冷冻或被冷冻干燥损伤的敏感微生物的保藏。该技术已被成功地用来保存一些酵母和丝状真菌孢子。

02、长期保存

2.1 冷冻干燥

真菌使用华体会体育最新地址在最佳条件下生长将最大限度地形成孢子。成熟的孢子通过用2mL含20%无菌脱脂牛奶的溶液浸泡琼脂华体会体育最新地址获得。脱脂牛奶使用后必须冷冻保存，因此，它在使用前被储存在2~8℃。将孢子从菌落表面轻轻刮下，调制成浓度至少为10^6个孢子/mL的悬浮液。孢子悬浮液用移液器吸回含有牛奶的管子里并彻底混匀。如果是在使用一个以上管子的情况下，重复该程序并将悬浮液汇集于一个试管中，获得的浓度至少为10^6个孢子/mL。生长在液体华体会体育最新地址中的菌株通过离心获得孢子，并重悬于20%无菌脱脂液中。约0.2mI的孢子悬浮液被分装到无菌小瓶冷冻干燥。收获孢子的时间间隔和分配过程必须被尽量缩短，因为许多孢子在悬浮于液体中时开始发芽。孢子在处理前不应该在脱脂牛奶中超过2h。充满孢子的小瓶应冷藏保存并等待进一步的处理。真菌的冷冻干燥使用的是一种已经被ATCC描述过的方法。冻干的孢子可以存储在2~8℃。可以通过将小瓶储存在-70℃的机械冷冻室中来延长保质期。

冷冻干燥的真菌株可以用0.5~0.9mL的无菌水再水化，然后转移至含有6mL无菌水的试管中浸泡50~60min后再接种于固体华体会体育最新地址上。在ATCC，酵母是用与细菌相同的组合冷冻干燥法来处理。菌株在合适的固体华体会体育最新地址上生长，并悬浮在无菌的20%脱脂牛奶或试剂18中，调节浓度至少为10^6个细胞/mL。悬浮液充分混合，然后每支0.2mL分装到小瓶中。如前所述，使用组合冷冻干燥法冷冻干燥菌株。

2.2 超冷冻或深低温保存

在液氮的超低温度下保存真菌(液相-196℃，气相-150℃)被认为是目前最佳的存储方式。该方法可以应用于形成孢子和不形成孢子的菌株，以及那些遗传基因改变或者导入质粒的真菌。适用于细菌的冻结速率和防冻剂也同样适用于真菌的冷冻。通过使用10%甘油或5%DMSO浸没斜面或平板并轻柔刮擦培养物表面来获得孢子或菌丝体碎片。真菌悬浮液0.5mL/瓶分装进无菌塑料冷冻瓶中并控制好降温速率。产生黏菌丝体或菌丝深入琼脂生长的真菌，可以使用无菌钻孔器(5mm)切割培养中的琼脂(hyphyltip)用于冷冻。3个或4个琼脂块置于一个无菌塑料冻存管中，然后加入0.4mL10%甘油，在一个缓慢的可控的速率下冻结。

在生物罩中使用无菌搅拌器，将在液体华体会体育最新地址中生长的菌种打成片段，然后悬浮在20%甘油或 10%DMSO与生长华体会体育最新地址的等体积混合物中，得到最终浓度分别为10%(V/V)甘油或5%(V/V)DMSO的悬浮液。一些菌株必须通过离心浓缩才能获得足够的冷冻材料。病原体不能浸渍后使用机械搅拌，因为可能会有气雾扩散的危险。

一些菌种，如伞菌属(Agaricus)菌株，由种子谷物或者花粉组成，可以在无冷冻保护剂下冷冻。黏菌可以通过冷冻干燥或冷冻来保存。孢子、微囊和内孢囊在10%甘油中通过控制好的冷冻速度保存并储存在液氮的气相中。菌种复苏应该在37℃水浴适当搅动，使其迅速完成。一旦冰融化完全，菌种可以被转移到合适的华体会体育最新地址中。

酵母细胞已通过可控冷冻速率被成功保存到液氮温度下(液相-196℃，气相-150℃)。酵母培养物的处理方式与细菌一致，生长则与酵母冷冻干燥部分一致。细胞悬液用10%甘油制备，浓度至少为10^6个细胞/mL。酵母在可控条件下的冷冻过程与细菌部分一致。一些报道中描述了冷冻干燥或不恰当冷冻过程会导致质粒丢失现象或诱导呼吸缺陷型酵母突变体出现。Nierman和Feldblyum在报道中指出，当含有质粒的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在液氮中冷冻保存时未观察到活性下降，在冻存前后细胞中包含的质粒片段是一致的。含有质粒的酵母在可控温的液氮中保存比使用冷冻干燥保存更有优势。

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