目的:分析研究镍亲和层析介质寿命的检测方法。

方法:层析柱维护清洗后的清洗效果需要检测pH、电导率和UV，实验前测量柱效，若结果异常时再进行柱效复核检测，以TOC、电导为主要检测指标，淋洗水内毒素为辅助检测项目。循环100次。

结果:TOC检测值范围在22.700～262.000ppb之间，RSD为77.027%;pH检测值范围在5.400～6.900之间，RSD为7.103%;内毒素检测值范围在0.600～1.100EU/mL之间，RSD为9.443%;洗脱蛋白未检出，电导均＜0.25μs/cm;TOC洗脱峰波动明显，pH洗脱峰稍有波动，电导洗脱峰相对平稳。

结论:等比例缩小实验规模为商业生产的1/1000(规模没有固定标准，结合自身实际情况)，保持生产线性流速，以产品sop作为参考，结合产品的收率，纯度、载量、柱压、评估每次循环后的结果，对结果进行统计分析，依据各个指标的稳定性，综合判断介质使用寿命。

在我国生物技术水平不断提升的社会背景下，生物制药技术快速发展，生物制品质量需求也逐渐提升，生物制品从研究到上市，需要经过药理毒理研究、药学研究、临床试验等一系列流程，以确保生物制品的有效性、安全性和质量可控性。但相关部门明确指出，生物制药不仅要保证生物制品有效性，同时也不能影响其生产工艺稳定性。作为生物制药过程中的关键步骤，层析技术可利用层析介质对培养、收集到的生物制品进行纯化处理，以获得符合生产标准的生物制品，但在纯化处理过程中，物料中存在的宿主蛋白、核酸、脂类、内毒素、杂质等会残留在层析介质当中，对其造成污染，进而在下一次纯化中污染目标产品，因此明确层析介质寿命，并对其进行及时更换，对于提高生物制品质量具有重要意义。本次研究对亲和层析介质寿命检测进行研究，现报道如下。

一、材料与方法

(一)试剂。选用试剂包括重组蛋白(治疗类生物制品)原液、二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、氯化钠(NaCl)、咪唑(Imidazole)、六水合硫酸镍(NiSO4·6H2O)、鲎试剂和注射用水。

(二)设备仪器。选用仪器包括:B－T100型TOC检测仪(青岛路博建业环保科技有效公司生产)、CD－TDS电导率检测仪(无锡朝达电子科技有限公司)、PHB－1酸碱度手持式pH计(青岛景弘环保科技有限公司生产)、MS204TS电子分析天平(瑞士梅特勒－托利多集团公司生产)、SW－CJ－2FB超净工作台(苏净净化设备有限公司)。

(三)平衡液制备。应用分析天平称取NaH2PO4·2H2O0.06g、Na2HPO4·12H2O5.7g、NaCl29.2g、imidazole，1.36g加水溶解并定容至1L。置入规格1L容量瓶中，注入适量注射用水，轻轻摇动使其完全溶解，注入注射用水至定容。

(四)洗脱液制备。应用分析天平称取2.80gNaH2PO4·2H2O，0.72gNa2HPO4·12H2O、29.22gNaCl和13.60gImidazole置入规格1L容量瓶中，注入适量注射用水，轻轻摇动使其充分溶解，再注入灭菌注射用水定容。分析天平称取26.28gNiSO4·6H2O置入规格1L容量瓶中，注入适量注射用水后轻摇使其充分溶解，再注入注射用水至定容。

(五)检测方法。各工序参数的设置、流速、样品洗脱方法、层析柱再生等均根据自身产品工艺的相关规定进行操作，缓冲液、试剂均检验合格与生产保持一致。由于药液价格昂贵，本次研究验证上样量仅按照生产规模层析柱体积与生产上样量比例的1/1000进行上样，柱床高度要求与生产规模一致。纯化所用液体与生产一致，在缓冲液匹配后，用0.45μm膜过滤，去除颗粒。生产时需要测量pH、电导率和UV，产品接触时间与生产规模保持一致。层析柱在实验前，测量柱效(HETP，理论塔板数)，确保与生产规模保持一致。在制品结果出现异常时再进行柱效检测。每步纯化按100次循环准备上样样品。调节pH至8.0，线性流速70～75cm/h，上样。以OD280监测，收集洗脱峰，测蛋白浓度。

(六)取样量。内毒素/下样取样瓶需干烤备用，总有机碳(TOC)取样直接用TOC专用取样瓶，排除样品瓶对样品的污染，避免对本次验证产生干扰，本次研究各检验项目取样值分别为TOC(淋洗水)40mL、蛋白(淋洗水)10mL、pH(淋洗水)15mL、电导(淋洗水)10mL、内毒素(DEAE/淋洗水)2mL。

(七)检测值标准范围。TOC:检测值＜500.000ppb;蛋白:检测值为0mg/mL;pH检测值＜8.000;电导:检测值＜0.250μs/cm;内毒素:检测值＜1.000EU/mL。

(八)统计学方法。采用SPSS26.0软件处理数据，计算数据RSD值，并根据数据做出折线图。

二、结果

(一)各项目淋洗水检测结果。经100次循环检测，TOC检测值范围在22.700～262.000ppb之间，RSD为77.027%;蛋白含量均为0;pH检测值范围在5.400～6.900之间，RSD为7.103%;电导检测值均＜0.25μs/cm;内毒素检测值范围在0.600～1.100EU/mL之间，RSD为9.443%。详见表1。

(二)各项目洗脱峰结果。TOC洗脱峰波动明显，pH洗脱峰稍有波动，电导洗脱峰相对平稳，详见图1。

三、讨论

在生物制药领域，层析纯化是关键步骤，层析介质循环使用次数直接影响分离提纯效果。根据不同产品特性和物料性质，介质寿命均不相同。本文以金属螯合镍亲和介质为例，通过金属螯合亲和介质的原理与使用方式，来检测介质寿命。金属螯合亲和介质捕获蛋白质表面的氨基酸，分离出对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。针对其纯化原理，研究介质寿命验证方法与清洗检测，为研究不同用途的层析介质寿命提供思路与数据支持。介质寿命验证是药品研发，尤其是生物制品的重点关注内容。企业在做介质寿命验证时，建议采用等比例缩小纯化规模，确定每步纯化所用介质的使用次数，确保层析介质寿命在使用期限内使用，介质符合生产需求，防止交叉污染，保障产品的质量合格。层析介质在每次使用时，未被洗脱和流穿的物质或杂质会吸附在填料上，需要采用特定的清洗和再生程序对层析介质进行清洗、再生、保存，以恢复介质最初状态。长期使用的介质，会逐渐失去效力，如清洗后污染物残留量、介质使用参数变化、产品重要指标(纯度)和收率均不在控制范围之内，则说明介质的寿命已到期。亲和层析是一种吸附层析，抗原(或抗体)和相应的抗体(或抗原)发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原(或抗体)固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体(或抗原)选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。与产品实际生产的SOP作对比，如不在SOP控制范围内，则说明介质应该更换了，只有对层析介质进行及时更换，才能确保生物制品质量。本次研究结果显示，TOC检测值范围在22.700～262.000ppb之间，RSD为77.027%;pH检测值范围在5.400～6.900之间，RSD为7.103%;内毒素检测值范围在0.600～1.100EU/mL之间，RSD为9.443%;蛋白未检出，电导均＜0.25μs/cm;TOC洗脱峰图波动明显，pH洗脱峰图稍有波动，但都电导洗脱峰图相对平稳，结果表明，虽然TOC和pH峰图存在一定波动，但其检测值均处于正常标准范围内，另外内毒素作为辅助参考指标，最高值达到1.100EU/mL，已超出标准范围，但检测难免存在误差，经计算内毒素平均值仅为0.967EU/mL，符合标准范围。

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