1.Protein A填料纯化抗体原理：

Protein A是一种存在于各种金黄色葡萄球菌的细胞壁上细胞壁受体，它具有和IgG进行特异性结合的能力，天然的Protein A含有5个区域可以结合IgG。经过改造后的Protein A可以拥有比天然Protein A更优异的性能，比如与IgG的亲和力更强，酸碱耐受能力提高等。将Protein A蛋白偶联至填料上，即可从发酵液，动物腹水或血清中纯化IgG及其亚类。

★ Protein A可以与IgG的Fc片段中重链CH2和CH3连接处的一段氨基酸序列产生特异性结合，此外还可以与Fab片段中重链CDR2和CDR3区域进行结合

※对于不同物种的IgG，由于其氨基酸序列的不同，其对Protein A的结合能力也不同。对于同一物种，不同亚型的抗体对Protein A结合能力也会出现不不同的情形

2.ProteinA填料介绍：

Protein A填料主要是通过偶联试剂将填料基质进行活化，再将ProteinA蛋白与活化基团进行反应并以共价键的形式与填料连成一个统一的整体。

天然的Protein A蛋白十分稳定，在4mol/L尿素、硫氰酸胍、6mol/L的盐酸胍和pH2.5的酸性条件以及加热煮沸均不影响其活性。

将天然的Protein A中的不耐碱氨基酸进行突变进行改造，可以制备出更加稳定的Protein A蛋白，目前市场上已经有可以耐受1M的NaOH的Protein A填料。对于耐碱的Protein A，不仅可以使填料的再生更加方便，对内毒素的控制也更加的方便简单。

对于Protein A填料采用的基质主要有琼脂糖基质，葡聚糖修饰的琼脂糖基质，纤维素基质，以及聚合物基质(如PS基质，硅胶基质)。基质的材质可以影响配基的偶联量，继而影响填料的载量；基质粒径及孔径的大小可以影响纯化过程使用的流速以及抗体与填料的结合速率；基质的材料组成可以影响纯化后填料的清洗方式等

3.ProteinA填料纯化抗体的流程：

所需试剂：

平衡：1X PBS ，pH7.4

洗杂Buffer：1X PBS +适合浓度的盐，pH7.4

洗脱Buffer：0.1M甘氨酸或0.05M/0.1M柠檬酸或0.1M醋

酸 (pH范围为2.0~4.0)

中和Buffer：1M Tris-HCl， pH8.5

实验步骤：

1.将Protein A填料装入层析柱中，使用≥ 5倍填料体积的平衡Buffer对填料进行平衡

2.将样品进行上样过柱(样品上样前需经过0.45um/0.22um的滤膜过滤处理)，上样流速参照选用Protein A填料说明书

3.使用5~10倍填料体积的洗杂Buffer清洗填料

4.使用3~5倍填料体积的洗脱Buffer进行洗脱，收集洗脱液时可以分管进行收集

5.向收集的洗脱液中加入1/10倍体积的中和Buffer

6.填料再生：使用3倍体积平衡Buffer清洗填料，再使用2~3倍填料体积的0.1~0.5M的NaOH溶液流经填料15~30min以除去残留在填料上的抗体以及结合在填料上的杂质，最后使用5倍填料体积的除菌的平衡Buffer清洗填料

※对于使用NaOH溶液不能够将填料清洗干净，可以先用0.1M的硫代乙醇进行清洗填料，然后再用NaOH溶液进行清洗

※填料的灭菌可以使用含30%~40%异丙醇的0.1~0.5M NaOH溶液进行清洗

一般情况下，使用Protein A填料一步纯化就可获得95%以上的抗体纯度，对抗体的特异性吸附非常高，对其他杂蛋白的非特异性吸附非常低

4.ProteinA/Protein G对各类型抗体亲和力比较

FAQ：

1.纯化出的抗体量少

①检查样品流经填料后的穿透液→如穿透液中有大量未结合的抗体，可以换用其他配基的填料如Protein G填料；可以降低上样流速

②抗体在洗脱的过程中发生了沉淀→优化洗脱液，如适当提高洗脱液的pH；在低温下洗脱

③抗体与填料结合牢固，未能被洗脱→使用更低pH的洗脱液洗脱；增加洗脱液的盐浓度

2.纯化的抗体中含有大量杂蛋白

①使用的填料过多→根据填料的载量减少填料的使用量

②洗杂不充分→增加洗杂液的体积；适当提高洗杂液中的盐浓度；适当调低洗杂液的pH进行洗杂

③非特异性吸附→在洗杂液中加入终浓度为0.1%的Tween-20

④抗体发生降解→处理样品时加入蛋白酶抑制剂

⑤未知原因→洗脱时采用分管收集

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