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杂菌的类型

空气中的微生物大多数是细菌和芽孢，还有一定数量的霉菌、酵母和病毒。细菌的大小有零点几微米至几个微米。这些微生物在空气中极少单独游离存在，基本上是附着于灰尘、液滴等微粒的表面上。介质过滤除菌就是把空气中的各种微粒和极少量的游离微生物捕集起来予以除掉。详见下表：

无菌检查与染菌的处理

在发酵生产过程中，为了及早发现染菌并进行恰当处理，保证生产正常进行，对菌种制备、种子罐、发酵罐的接种前后和培养过程中，须要按工艺规程要求按时取样，进行无菌检验。

2.1 无菌检查

培养液是否污染杂菌可从三个方面进行分析：无菌试验、培养液的显微镜检查、培养液的生化指标变化情况。其中无菌试验是判断染菌的主要依据。

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2.2无菌试验

现在采用的无菌试验方法有LB 培养法、平板培养法、斜面培养法。其中以酚红LB 培养法和平板培养法结合起来进行无菌检查用的较多。

(1)LB 培养法：直接用装有酚红 LB 华体会体育最新地址的无菌试管取样，然后放入 37°C恒温室（箱）内培养。定时观察试管内华体会体育最新地址的颜色变化，同时进行显微镜观察。

(2)斜面培养法：先用空白无菌试管取样，然后在无菌条件下接种于斜面华体会体育最新地址上，置于 37°C恒温室(箱)内培养。定时观察有无杂菌菌落生长。

(3)平板培养法：:种子罐样品先取入 LB 华体会体育最新地址中，然后在无菌条件下在平板华体会体育最新地址上面划线，剩下的 LB 培养物在恒温室(箱)内培养 6 小时后复划线一次，发酵罐培养液直接取入空白无菌试管中，于 37°C下培养 6 小时后在平板华体会体育最新地址上划线。24 小时内的平板定时在灯光下检查有无杂菌生长。24小时~48 小时的平板1天检查一次。以防生长缓慢的杂菌漏检。正常生产过程中,种子罐和发酵罐每隔 8 小时取样一次，进行无菌检查。该方法经常用于单菌落挑选，可以从染有杂菌的培养液中经多次划线挑取单菌落进行分离培养，得到纯种的种子。

无菌试验的结果一般需要 8~12 小时才能作出判断。为了缩短判断时间，有时向华体会体育最新地址中加入赤霉素、对氨基苯甲酸等生长激素以促进杂菌的生长。

2.3染菌的判断

以无菌试验中的酚红LB培养和平板培养的反应为主，以镜检为辅。每个无菌样品的无菌试验，至少用2只酚红LB或斜面同时取样培养。要定量或用接种环蘸取法取样，因取样量不同，影响颜色反应和浑浊程度的观察。如果连续3个时间的酚红LB无菌样发生颜色变化或产生浑浊，或斜面连续3个时间样品长出杂菌即判断为染菌。有时酚红LB反应不明显，要结合镜检确认连续3个时间样品染菌，即判为染菌。各级种子罐的染菌判断亦参照上述规定。

对 LB 和无菌斜面的观察及保存期的规定，发酵华体会体育最新地址灭菌后应取无菌样，以后每隔 8小时取无菌样一次，直至放罐。无菌试验的 LB 和平板应保存并观察至本批放罐后 12 小时，确认无杂菌污染后方可弃去。无菌检查时间应每 6 小时观察一次无菌试验样品，以便能及早发现染菌。

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染菌原因分析

染菌是发酵工业的大敌，不制服染菌就不能实现优质高产。在抗生素发酵生产中造成发酵染菌的原因很多，分析染菌的原因是很困难的。但在众多的原因分析中，从人、机、料、法、环各个环节进行细致的分析。从多方面查找原因，查出杂菌的来源，采取相应措施予以制服。

3.1 从染菌的规模分析

在发酵过程中，如果是种子罐和发酵罐同时大面积染菌，杂菌的主要来源可能是空气净化系统，如空气过滤器失效或空气管道渗漏造成的。其次考虑种子制备工序。如果只是发酵罐大面积染菌，除考虑空气净化系统带菌外，还要重点考查接种管道、补料系统。发酵华体会体育最新地址采用连续灭菌工艺时，还要严格检查连消系统是否带入杂菌。

3.2从时间分析

①　初始染菌：在发酵初期，菌种刚刚接入发酵罐中的一段时间内，可能会出现染菌现象。这可能是由于菌种不纯、华体会体育最新地址灭菌不彻底、发酵设备存在缺陷等原因导致的。初始染菌往往会影响整个发酵过程的顺利进行，需要及时采取措施进行解决。

②　中期染菌：在发酵过程中，如果染菌规模较小，且出现在发酵中期，可能是由于华体会体育最新地址营养成分不足、溶氧不足、代谢产物积累等原因导致的。中期染菌可能会影响发酵产物的产量和质量，需要及时调整发酵条件来控制染菌规模。

③　后期染菌：在发酵后期，如果染菌规模较大，可能是由于菌种老化、营养物质消耗殆尽、代谢产物积累等原因导致的。后期染菌往往会对整个发酵过程产生较大的影响，需要及时采取措施进行解决。

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案例分析

案例分享：大观霉素发酵生产的染菌率较低。个别发酵罐染菌后，生长代谢所受影响也较小，大多能正常周期放罐，发酵单位所受损失也不大。99年出现的几批染菌罐却表现出了很大异常:确定染菌后，发酵罐PH开始急剧下降，糖耗快，氨氮降低，发酵单位开始下滑，只能提前放罐。严重影响正常。本文从染菌原因分析，给制服无菌提供了一个新思路，为国内抗生素生产厂家对制服染菌有借鉴作用。

为找清染菌原因，从染菌罐分离出杂菌，考察其培养特性，做耐热实验。然后根据这种菌在发酵华体会体育最新地址中的生长速度，推算出杂菌进入发酵罐的时间，最终确定了染菌原因，并采取了相应的措施，制服了这次染菌。现将这次染菌的原因分析及相应的对策介绍如下。

（一）染菌特征

①　发酵罐培养至 50 小时左右，33 小时后的无菌 LB 跟踪样开始变色，确认染菌。此后，发酵罐 PH 开始急剧下滑，糖耗快，氨氮下降，发酵单位停止增长，60 小时左右提前放罐。

②　变色 LB 涂片镜检：短杆菌。

③　发酵液(周期 60 小时左右) 涂片镜检：杆菌，已经形成芽孢。

（二）杂菌分离、培养

①　把变色LB 接入无菌红色 LB，37°C恒温培养。24 小时后 LB 变黄，表明这种菌代谢产生酸性物质。

②　向变色 LB 中加入2滴 5M的NaOH 溶液，摇匀 (PH为 10)，放置 10 分钟。把该 LB 接入无菌LB，37C恒温培养 48 小时，LB 仍不变色。说明这种杂菌对碱性环境的耐受性较差。

③　用细菌华体会体育最新地址对这种杂菌进行平板分离，杂菌菌落具有细菌菌落的典型特征。挑取单菌落接入 LB，培养特征与直接从染菌罐接入的LB 中的杂菌一致。镜检，杂菌呈短杆状，可观察到部分菌体进行二分裂繁殖。

④　把杂菌接入菌种效价跟踪用的发酵瓶，培养情况与发酵罐的代谢情况类似。

⑤　把杂菌接入空白发酵瓶，培养 24 小时后进行平板分离及 LB 检测，结果证明这种菌能在发酵瓶中存活、生长繁殖。由于发酵瓶和发酵罐的营养成分、培养条件一致，因此可以用发酵瓶来模拟杂菌在发酵罐中的生长情况。

（一）杂菌耐热性实验

用牛肉膏蛋白陈液体华体会体育最新地址培养这种菌，吸取定量体积的菌液分别接入 11 支无菌LB。取 1 支作对照，另10 支每2 支为 1 组，分别在 100℃沸水浴中加热5 分钟，10 分钟,15 分钟,20 分钟,25 分钟。37℃恒温培养 24 小时，只有加热 25 分钟的两支 LB 不变色。说明这种菌的耐热性较强。

（二）染菌时间判断

把杂菌接入空白发酵瓶，在不同培养时间取样，进行平板菌落计数，计算出发酵瓶内的菌体数。该菌的繁殖方式为二分裂，根据培养时间和菌体数目的对应关系，可以计算出该菌在发酵瓶内繁殖一代所需的时间（代时）。

(1)制备菌体稀释液（浓度约每毫升几百个）

从平板上挑取单菌落，按梯度稀释法制得菌体稀释液（约 520 个/毫升）。

(2)代时的确定吸取 1 毫升稀释液接入空白发酵瓶 (30 毫升华体会体育最新地址，发酵瓶培养条件与发酵罐培养条件保持一致。在不同时间取样，进行平板菌落计数。计算出对应的菌浓和菌体数，如下表：

培养时间（小时）	取样量（毫升）	菌落数（个）	菌浓（个/毫升）	菌体数（个）
0	0.5	16	32	960
1.5	0.5	40	80	2400
3.0	0.2	49	245	7350
4.5	0.2	122	610	18300
6.0	0.1	172	1720	51600

根据公式：

其中，X1为时间t1时的菌体数量；

X2为时间 t2 时的菌体数量；

T 为代时（繁殖一代所需的时间）

(3)发酵罐染菌时间的推算

出现的连续几批染菌罐，染菌特征一致，染菌为上述耐热短杆菌。

取培养时间为 50 小时的染菌发酵液，进行梯度稀释、平板菌落计数，计算得到发酵罐在 50 小时的杂菌浓度为 9.08x107个/毫升。发酵液的体积按 12 立方米计算，杂菌总数量为1.09x10 15 个。

以杂菌在发酵液中的代时为 1.1 小时计算，杂菌进入的数量与繁殖到 1.09x10 5 个所需的时间如下表，可能的染菌时间即为转运周期与杂菌繁殖时间的差值。排除杂菌一次以极少数目 (几个或几十个) 进入可能性，大致得染时间应为 10 到20 小时之间。

杂菌进入数量 (个)	杂菌繁殖到1.09x10¹⁵个所需时间(t2小时)	染菌时间 (50-t2小时)
1	50	0
100	43	7
1000	40	10
100000	33	17

发酵罐运转至 10 到 20 小时正好是补料开始的时间。所以几乎可以肯定是补料系统出现问题造成了这次染菌。染菌菌型的一致性以及染菌面积也说明了这一点。

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应对措施

根据染菌原因分析，我们对补料系统进行了一次彻底的检查和改造，并针对这种菌耐热不耐碱的特性制定了相应的清洗消制度，染菌很快得到了控制。

1、提高补料系统蒸汽消毒的温度和压力，延长消毒时间；

2、定期用甲醛熏消补料系统；

3、用稀碱水煮补料罐，然后用稀碱水冲洗补料管道；

4、对补料系统中可能的消毒死角进行改造。

5.1解决发酵罐的芽孢污染的方法

杀灭芽孢最有效的方式之一采用杀孢子剂（Sporicide）处理。杀孢子剂是个舶来词，是英文Sporicide的翻译，意思是能够杀灭“spore”的药剂，由于spore同时代表芽孢和孢子，孢子也是一种常见的高抗性微生物种类，所以Sporicide被译为杀孢子剂，但其最合理的解释应该是杀芽孢剂。

从名称上就可以看出，杀孢子剂能够有效杀灭芽孢。所以在发酵罐进行蒸汽灭菌前，可以使用杀孢子剂对发酵罐进行预处理消毒，消除可能存在的芽孢污染，这将有效保障蒸汽灭菌的成功率。另外，使用杀孢子剂可有效解决无法耐受高温蒸汽的环节中的芽孢污染。

奥克泰士Oxytech来自德国，作为一款卓越的杀孢子剂和灭菌剂，能够有效杀灭包括耐热芽孢在内的所有类型微生物。奥克泰士Oxytech采用特殊的复合工艺制造，具备多重机理杀菌作用，所以其独特优势之一就是可以在较低的药剂浓度下实现对芽孢的彻底杀灭，这样就同时具备了良好的材料相容性，将腐蚀性控制在了极低的水平之内。其作用完毕后分解为水和氧气，生态安全，不会对后续的发酵工作产生影响，保护操作人员的职业健康。