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蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)原理：

在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，因而蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的蛋白质复合物。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，即分为浓缩胶和分离胶。浓缩胶的作用是具有蛋白聚集浓缩作用，凝胶的浓度较小、孔径较大。不同蛋白在浓缩胶中的迁移速率一致，在电泳过程中不断被浓缩至一个狭窄的区带。当蛋白进入分离胶后，由于分离胶浓度较大、孔径较小，分子量小的蛋白由于体积较小，在凝胶中的迁移速率快，分子量大的蛋白迁移率慢，于是就造成不同分子量的蛋白便逐渐被分开。

材料与试剂：

1,30%的丙烯酰胺：称取29g 丙烯酰胺和1g N,N -亚甲双丙烯酰胺加入60ml去离子水中，加热至37℃溶解，补加水至终体积为100ml,使用0.45um滤膜过滤，即配成30%（w/v）丙烯酰胺溶液。丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化，故溶液的pH值不要超过7.0，储存时应置于棕色瓶中4℃保存。

2,10%十二烷基硫酸钠（SDS）：称取10gSDS加去离子水90ml加热至68℃，加几滴浓盐酸调节至pH7.2加水至100ml，即为10%（w/v）SDS。

3,浓缩胶缓冲液（1mol/L Tris-HCl pH 6.8）：称取12.12g Tris溶解在80ml去离子水中，加入浓盐酸调节pH至6.8,再加去离子水定容至100ml，2~8℃保存。

4,分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8）：称取18.16g Tris溶解在80ml去离子水中，加入浓盐酸调节pH至8.8, 再加去离子水定容至100ml，2~8℃保存。

5,10%过硫酸胺（AP）：过硫酸胺提供催化丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基，可用去离子水配制小量10%（W/V），由于过硫酸胺会缓慢分解，最好现用现配。

6,TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)通过催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合，由于TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，因此pH值较低时聚合反应受到抑制。

7,Tris-甘氨酸电泳缓冲液：分别称取15.1g Tris 和94g甘氨酸，溶解在900 ml去离子水中，再加入50 ml 10%（w/v）SDS，补加去离子水至1000 ml则成5×贮存液。使用时用去离子水稀释5倍即可配置成终浓度Tris为25mmol/L、甘氨酸为250mmol/L、0.1%SDS，缓冲液pH~8.3。

8,聚丙烯酰胺凝胶电泳槽和电泳仪

9,移液枪和吸头等

实验步骤：

1,用两块干净的玻璃板，玻璃板对齐后放入夹中卡紧，并固定在灌胶支架上。

2,根据待分离蛋白物质分子量的大小，参照表1确定最适的丙烯酰胺凝胶浓度，按照表2配制所需体积的分离胶，根据表中的试剂顺序从上到下依次加入各所需体积的试剂，轻轻搅拌混匀。

表1：

表2：

3,迅速将分离胶注入两玻璃板间隙中，留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再加1cm，用滴管小心地在分离胶上覆盖一层0.1% SDS（当丙烯酰胺浓度≤8%时）或异丁醇或水（当丙烯酰胺浓度≥10%时），覆盖层可防止氧扩散进入凝胶而抑制聚合反应，将凝胶垂直置于室温下聚合30min，如过温度较低可延长聚合时间；

4,分离胶聚合完全后，倒出覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺，清洗完成后尽可能排除凝胶上层残留的水；

5,按表3配制所需体积的浓缩胶，然后直接将浓缩胶灌注在分离胶上部，立即插入清洗干净的配套梳子，插入时需避免气泡，然后加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙。待浓缩胶聚合后，拔出梳子，形成加样孔。

表3：

6,用去离子水将Tris-甘氨酸电泳缓冲液贮存液稀释5倍，倒入电泳槽内槽并加满使其溢出至外槽，如过加样孔充有气泡，可用电泳缓冲将加样孔中的气泡液吹打排除。

7,向胶孔内加入5ul蛋白Marker，然后依次匀速加入待检测的蛋白样品。若有多余的孔，可以在胶孔两侧补齐上样缓冲液（Loading Buffer）。

8,在电泳槽外槽加入适量电泳缓冲液(液面高度需低于内槽)，先在恒压80V下电泳30min，再调整为恒压120V下电泳约90min至指示剂距离凝胶最下端1cm左右处。 (注：不同的胶浓度所需电泳时间需有所不同)。

9,在电泳完成之后，将凝胶板从电泳槽中取出，用胶撬将玻璃板撬开，取下凝胶至于去离子水中，如果不需要转膜，则可进行染色操作。

10,染色：按照如下配方配制染色液，倒适量染色液于染色盒中，将凝胶浸没于染色液中，置于脱色摇床中染色，转速45rpm，时间1h。

11,脱色：按照如下配方配制脱色液，倒适量脱色液于脱色盒中，将凝胶取出浸没于脱色液中，置于脱色摇床中染色，转速45rpm，时间1h。如果脱色不完全可换入新的脱色液，继续进行脱色至背景干净透明。

蛋白免疫印迹(WB)：

WB是一种把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持物(NC膜或PVDF膜)，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测。WB采用抗体作为探针，抗体可以与附着在固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生抗原-抗体免疫反应。这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物(即总蛋白混合物)中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析，旨在鉴别特异性蛋白的类型(如亚型、聚体、剪切体等)和蛋白表达量的变化。

材料与试剂：

转膜缓冲液：称取3.03g Tris、14.4g甘氨酸、加入至800mL水中溶解，再加入200mL甲醇混匀。

封闭液：称取5g脱脂奶粉加入至100mL的PBS溶液中。
洗涤液：吸取0.5mL的Tween-20加入之1000mL的PBS溶液中并混匀溶解。
PBS溶液：称取8.5g氯化钠、1.4g Na2HPO4、0.2g NaH2PO4、加入1000mL的水中，溶解后调pH7.4抗体稀释液：称取1g的BSA溶解至100mL的洗涤缓冲液中。

ECL kit

PVDF膜

实验步骤：

1,参照凝胶裁剪合适大小的PVDF膜并写上对应胶板、蛋白标记，再将PVDF膜浸入甲醇中~30s进行激活

2,在托盘内倒入适量转膜缓冲液，将海绵垫放入转膜液中，再将双层的比膜略大的滤纸平铺在海绵垫上。3,电泳完成之后，将胶取出，并用手术刀切除多余部分的胶，而后置于滤纸之上，保持胶面无气泡，将对应的PVDF膜在缓冲液中稍微浸泡一下，随后将写有标记的一面朝下覆盖在胶面上。用铲子轻轻压一压，使得膜与胶贴的更紧密一些，但要保证膜与胶之间无气泡产生，再取双层滤纸用转膜液润湿，覆盖在PVDF膜上，再将另一个海绵垫放于滤纸上，然后将该整体安装至转膜夹具上夹紧4,将组装好好的夹具放入电泳槽中，倒入适量电转缓冲液，设置电压100V，进行转膜，时间一般为1~2h。为了防止转膜时温度的过高，可以将电泳槽放入冰盒中。5,转膜完成后，取出的PVDF膜，正面朝上浸入倒有封闭液的塑料皿中。放置摇床慢速封闭1h。

6,在封闭好之前，采用5mlEP管稀释好对应膜的蛋白的一抗，稀释比例按照抗体说明书稀释。

7,倒去封闭液，加入稀释好的一抗，放于37℃摇床上孵育1h或置于4℃过夜孵育。
8,孵育完成后，倒去一抗溶液，用洗涤液对膜进行清洗，每次加入洗涤液后放于摇床摇晃清洗5~10min，共清洗4次。
9,在洗膜的同时，稀释HRP标记的二抗，稀释比例按照抗体说明书稀释。等待洗膜完毕后，将稀释后的二抗加至膜上，放于37℃摇床上孵育1h或置于4℃过夜孵育。

10,孵育完成后，倒去二抗溶液，用洗涤液对膜进行清洗，每次加入洗涤液后放于摇床摇晃清洗5~10min，共清洗4次。

11,将ECL kit中的A液和B液按1：1混合后，加至膜上，静置1min后进行曝光拍照。

以图片方式展示SDS-PAGE和WB过程