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CHO细胞是目前使用最广泛和最成功的哺乳动物细胞宿主系统，用于重组蛋白的工业化生产。相信在可预见的未来，CHO细胞依然会广泛用于重组蛋白产品的研究和生产。为了提高生产效率和生产出稳定可靠的产品，需要企业开发一个良好的细胞培养工艺。但细胞培养过程中较高水平乳酸的产生被广泛的观察到。较高水平的乳酸降低了蛋白的生产效率，同时对工艺的稳定性造成较大的干扰。给做细胞培养的同行带来了很多困扰。

在细胞培养初始阶段，细胞快速增长，普遍观察到乳酸的积累，同时伴随着谷氨酰胺（或谷氨酸）的快速消耗，NH4+的积累。随后乳酸变化出现两条不同的通路：乳酸开始被消耗和乳酸继续被积累。

从乳酸角度来看，CHO细胞分为：乳酸消耗性和乳酸生成性。线粒体天冬氨酸 - 谷氨酸载体（aralar1）和线粒体内膜的转移酶8 (timm8a)起了较大作用。Aralar1是重要的苹果酸 - 天冬氨酸穿梭体(MAS)的重要组成部分，这个系统促进了细胞质中 NADH pool的循环，这对维持糖酵解通量是必要的. 或者，可以通过丙酮酸转化成乳酸盐这一过程将NADH转化为NAD+，该过程由乳酸脱氢酶催化。因此，低效的MAS活性会导致乳酸积累的增加。将上述基因转入乳酸生成性的CHO细胞中能够看到明显的乳酸消耗，但转入到乳酸消耗性中，并没有作用，因为乳酸消耗性的细胞中这些酶的活性足够高。获得的数据表明，通过通过苹果酸 - 天冬氨酸穿梭过程，使得NADH得到更好的氧化，促进了乳酸的消耗，这导致糖酵解和线粒体氧化代谢之间更有效的联系。

CHODXB11和DG44可能代表最广泛使用的CHO衍生的宿主细胞系。它们都是甘氨酸，次黄嘌呤和胸苷的营养缺陷型，因此它们被补充到华体会体育最新地址中。华体会体育最新地址中通常富含葡萄糖和氨基酸，这可以通过快速且低效的碳源消耗解除代谢的限制，主要缺点是乳酸和氨的强烈积累，这对细胞生长和生产力具有不利影响。

导致高乳酸积累的两种主要代谢途径是糖酵解和谷氨酸分解

1 葡萄糖代谢

葡萄糖会进入两个代谢途径：糖酵解（图2.2），其产生用于生物合成和能量的中间体，以及戊糖磷酸循环，其产生用于细胞合成代谢的NADPH和用于核酸合成的核糖。

丙酮酸可以被乳酸脱氢酶（LDH）转化为乳酸。

三种限速酶控制糖酵解通量：己糖激酶，磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶。

NADH 必须被回收，以维持代谢通路对NAD+的需求. 这通常可以通过将丙酮酸还原为乳酸来实现。或者，NAD+可以在线粒体中再生，但这需要两个穿梭系统的活性：苹果酸/天冬氨酸穿梭或甘油-3磷酸盐穿梭，如果糖酵解速率太高，该过程可能是瓶颈

解释有氧糖酵解的其他假设推测大量葡萄糖摄取会超过TCA循环的氧化能力（DeBerardiniset al。，2008），从而导致丙酮酸积累并随后转化为乳酸。回补反应的缺乏，例如丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶催化的反应，将导致相同的丙酮酸积累（Godia和Cairo，2006; Neermann和Wagner，1996）。总体而言，限制性丙酮酸进入TCA循环的结果是线粒体氧化活性降低

最后，乳酸生产也被提出作为一种保护机制，以减少线粒体氧化代谢和随之产生的活性氧（ROS）积累

此外，可以通过激活缺氧诱导因子1a(HIF-1a)诱导有氧糖酵解. 该转录因子通常由低氧条件激活，促进参与糖酵解的不同基因的表达，例如：葡萄糖转运蛋白GLUT1，己糖激酶，LDH和丙酮酸脱氢酶激酶，PDK，抑制丙酮酸脱氢酶活性，因此降低了丙酮酸进入TCA循环。

此外，HIF-1a还通过抑制过氧化物酶体增殖物激活型受体γ辅活化子-1β(PGC-1β)的表达来调节线粒体的生物合成。该系统的激活导致细胞降低线粒体氧化代谢，提高糖酵解代谢。

总之，乳酸产生可以是葡萄糖代谢的复杂调节的结果，其反映了细胞对环境变化的适应性。

2.2 TCA循环和谷氨酰胺代谢

TCA循环的作用

实际上，谷氨酰胺首先脱氨基为谷氨酸，然后通过脱氨基或转氨酶反应将其转化为α-酮戊二酸。

转氨酶通过催化谷氨酸与丙酮酸或草酰乙酸的反应分别生产丙氨酸或天冬氨酸。因此，谷氨酰胺不仅与能量产生有关，而且与中间体合成有关。

在营养丰富的华体会体育最新地址中，谷氨酰胺也可以被部分氧化成苹果酸，然后在胞质中转化为丙酮酸和乳酸（谷氨酰胺解）。有趣的是，在肿瘤细胞中，谷氨酰胺分解是NADPH的主要来源，超过一半的谷氨酰胺衍生的碳转化为乳酸和丙氨酸。

图2.5：TCA循环允许通过中间体：柠檬酸盐，合成脂肪合成前体。谷氨酰胺还可通过谷氨酸分解途径促进乳酸积累。 ACL，ATP-柠檬酸裂解酶; ACC，乙酰辅酶A羧化酶; FAS，脂肪酸合成酶; ME，苹果酸酶; Ac-CoA，乙酰辅酶A; Mal-CoA，丙二酰辅酶A; MDH，苹果酸脱氢酶; LDH-A，乳酸脱氢酶-A; GLS，谷氨酰胺酶。

2.3 氧化磷酸化

在糖酵解和TCA循环期间产生的NADH和FADH2在线粒体呼吸链中被再氧化。电子从这些还原当量通过四个内膜蛋白复合物转移到最终的受体氧，然后转化为水。确切地说，NADH将其电子转移至复合物I / NADH辅酶Q还原酶，而将FADH2转移至复合物II /琥珀酸辅酶Q还原酶。然后将电子转运至复合物III /细胞色素c还原酶和复合物IV /细胞色素c氧化酶。同时，H +在膜间空间转移，建立电化学梯度，称为线粒体膜电位。因此，质子通过F0F1 ATP合成酶复合物产生ATP的驱动力。氧化每个NADH产生三个ATP分子，FADH2产生两个ATP。

寡霉素Oligomycin, F0 /F1 ATP 合成酶的抑制剂, 加入到培养体系中，终浓度 1 uM 用于评估有质子泄露引起的残余氧消耗。使用最终浓度为10ug / mL的抗霉素A（呼吸链的复合物III的抑制剂）来评估不是由于线粒体呼吸引起的残留氧化反应。

Ala和Ser是生糖型氨基酸（a glucogenic amino acids）

Gln是一个乳酸生产的重要的诱导因子（但不会影响细胞生长和葡萄糖消耗，在≤6Mm）。这种新陈代谢需要苹果酸外排出线粒体并转化为丙酮酸，最后转化为乳酸，产生NADPH。有文献报道Gln的耗尽会诱导乳酸的shift
前期较高水平葡萄糖浓度对乳酸的水平影响不大

有文献报道：如图7.2所示，亚克隆中的线粒体膜电位在培养的前5天与对照细胞系相当，而在第7天显着下降并达到对照的约80％，在第9天达到60％。

总之，迄今为止报道的数据清楚地表明华体会体育最新地址会影响乳酸的产生。此外，线粒体氧化代谢参与观察到的现象。
丙氨酸的补充，在两种细胞系培养结束时均增加NH-4水平，约为4至6 mmol / L
相反，乳酸受丙氨酸和铜水平的显着影响。
与华体会体育最新地址 2相比，降低的铜浓度也导致第9天乳酸水平增加。此外，它们在亚克隆中的作用比对照细胞更显着
线粒体中NADH / FADH2的可获得性降低的主要原因可能是由于TCA循环中的通量限制或较低的中间体可用性。
提出假设，吡啶核苷酸穿梭进入线粒体的过程收到损伤。事实上，在这种情况下，丙酮酸还原成乳酸将被用作替代NADH回收系统，需要能够进行糖酵解通量的进行
因此，提出乳酸补料作为防止使用丙氨酸的策略。（因此，乳酸补料策略，虽然有趣，但仅适用于表现出强乳酸消耗能力的细胞培养物，作为我们的对照细胞系，但不是对于那些表现得像亚克隆的细胞
铜是细胞色素coxydase复合物的辅助因子，它是电子传递链的组成部分。因此，用高铜补充细胞最有可能提高线粒体的氧化能力; 从而增加乳酸被氧化
铜很重要，但并不充足
特别是，他们报告了乳酸消耗期间几种AKT1调节基因的下调。 AKT1是葡萄糖摄取和代谢的已知刺激物，因此其活性的降低将导致糖酵解的减缓
通常在细胞培养中观察到苹果酸盐积累，这可能是由于克雷布斯循环中的瓶颈（Krebs cycle）

两个基因导致高乳酸产生的下调：aralar1（Aralar1促进谷氨酸与天冬氨酸的交换，它也是苹果酸 - 天冬氨酸穿梭的组分）和timm8a（线粒体内膜8a的转移酶）Aralar1编码线粒体天冬氨酸 - 谷氨酸载体（AGC），它是苹果酸 - 天冬氨酸穿梭体的组成部分，并且位于线粒体内膜中。该系统将还原力从细胞质转移至线粒体，该过程对于再生糖酵解进展所需的胞质NAD+池是必需的。实际上，草酰乙酸向苹果酸的细胞溶质还原释放NAD+。然后将苹果酸转移到线粒体基质中，换成α-酮戊二酸，在那里它被氧化回到草酰乙酸，产生NADH。然后NADH在电子传递链中被氧化以产生ATP。为了完成穿梭，草酰乙酸与谷氨酸反应生成天冬氨酸和α-酮戊二酸。因此，天冬氨酸被输出到胞质中以替换谷氨酸。最后，反向的转氨反应在胞质中发生，得到草酰乙酸。

存在另一种穿梭系统：甘油-3-磷酸盐穿梭体（GPS）。甘油-3-磷酸脱氢酶（G3PDH）的两种同种型参与该过程。细胞溶质G3PDH将磷酸二羟丙酮转化为甘油-3-磷酸，产生NAD+，然后，通过线粒体G3PDH将甘油-3-磷酸转化为磷酸二羟丙酮。该酶位于线粒体内膜的外表面，并且是FAD依赖性的。因此，与MAS相比，GPS具有较低的能量产率。此外，据报道，GPS过程不足以弥补MAS功能受损或细胞内NADH水平高的情况，例如在乳酸消耗期间。一般而言，根据文献分析，MAS过程似乎比GPS更重要，特别是当乳酸用作碳源时
具体而言，天冬氨酸 - 谷氨酸载体促进天冬氨酸进入胞质中，与谷氨酸和质子交换。由于其电流产生能力，AGC功能在活跃的线粒体中是有利的。已鉴定出该载体的两种同种型：AGC1（aralar1）和AGC2（citrin），属于钙结合线粒体载体家族，Aralar1在大多数组织中表达，主要是胰岛，肌肉和脑; 而citrin在肝脏中更富含，而它也参与尿素循环。AGC在穿梭体的运行中起着至关重要的作用，因为它促进了穿梭过程中唯一不可逆转的步骤。它的活性是钙刺激的。实际上，氨基末端延伸处具有EF-hand Ca2+结合基序，其面向膜间空间。这样，线粒体外钙水平可以调节AGC活性。
图3：苹果酸 - 天冬氨酸梭子。 cAAT和mAAT，细胞质和线粒体天冬氨酸氨基转移酶; cMDH和mMDH，细胞溶质和线粒体苹果酸脱氢酶; LDH，乳酸脱氢酶; OAA，草酰乙酸; a-KG，α-酮戊二酸。
另一种鉴定的基因timm8a是线粒体转位酶系统的组成部分。这种蛋白质复合物有利于细胞质的输入和线粒体蛋白质的正确定位
总之，考虑到基因表达数据和文献综述，推测在一些培养条件下观察到的较高乳酸产生可能与穿过线粒体的NADH受损有关。在这种情况下，LDH活性将在乳酸生产方向上受到青睐，作为再生胞质NAD+池的替代系统。
最后，即使观察到的下调的机制尚不清楚，aralar1和timm8a似乎是CHO细胞工程改善乳酸代谢的有希望的候选者。
有趣的是，当用25mM的AOAA处理对照细胞时，在第5天后切换到乳酸消耗被阻止，并且进一步积累
因此，这些结果支持了这样的假设：低效的NADH穿梭可能限制了乳酸的氧化。
在亚克隆衍生克隆中，诱导乳酸代谢转变伟消耗型最可能的结果是增加了TCA循环中丙酮酸氧化，同时NADH穿梭效率更高。.
正如所料，与未转染的亚克隆相比，所有sc＃克隆显示氧消耗显着增加（转入timm8a或Aralar1）
本章报道的数据证实aralar1和timm8a是改善工业细胞培养中CHO乳酸代谢的潜在靶标
亚克隆转染在第5天后能够转换为乳酸消耗，这不是由于糖酵解通量的减慢，而是通过苹果酸 - 天冬氨酸穿梭的更好的NADH氧化促进了它。
可能是，观察到线粒体中的苹果酸外排及其转化为丙酮酸有助于乳酸积聚。
低丙氨酸和高铜浓度被认为是维持代谢转换的重要因素
Aralar1是苹果酸 - 天冬氨酸穿梭（MAS）的关键成分，可以氧化细胞质NADH
在糖酵解期间，在每个循环产生两分子NADH，并且它们需要再循环以维持糖酵解通量。这可以通过苹果酸 - 天冬氨酸穿梭或通过丙酮酸还原成乳酸来实现。因此，如果MAS活性受损，如在aralar1表达低的情况下，将增强LDH途径.
另一个基因timm8a是线粒体转运机制的一个组成部分，可促进靶向内膜的蛋白质的正确锚定，如aralar1
因此，可以提出氧气消耗的监测作为选择具有最佳代谢的克隆的工具，或者用于营养物筛选以改善华体会体育最新地址组成的工具。