水稻秸秆发酵方案

• 转基因水稻的预处理

采收新鲜水稻茎秆，切成3cm左右的小截，平均分成三组备用

①将第一组浸入蒸馏水中，45℃水浴1h；

②将第二组浸入50%的硫酸中，120℃水解1.5h，水解完成后用氢氧化钠调节pH至5.0；

③第三组不做任何处理

将上述三组置于烘箱105℃烘干后，研磨成粉，过40目筛。

• 纤维素酶水解

加入乙酸--乙酸钠纤维素酶溶液（pH为4.8），37℃水浴24h。

• 还原糖含量的测定（DNS法）

①葡萄糖标准曲线的绘制

按照下表配制不同浓度梯度的葡萄糖标准液：

编号	葡萄糖溶液浓度（mg/L）	葡萄糖溶液体积（mL）	去离子水（mL）	DNS试剂（mL）
0	0	0	3	2
1	0.1	2	1	2
2	0.2	2	1	2
3	0.3	2	1	2
4	0.4	2	1	2
5	0.5	2	1	2
6	0.6	2	1	2

沸水浴5min后迅速用ddH₂O冷却。以0号为空白对照调零，利用分光光度计测定在520nm处的吸光值，重复测量三次取平均值。以葡萄糖含量（μg）为横坐标，OD_520nm读数为纵坐标，绘制出标准曲线。

②样品还原糖含量的测定

取1mL待测样品，沸水浴5min后迅速用ddH₂O冷却。12000rpm离心1min后取上清测量在520nm处的吸光值。重复三次取平均值带入葡萄糖标准曲线，通过标准曲线计算还原糖含量。

• 乙醇发酵实验

①酵母菌株的活化与保藏

取1g高活性干酵母溶于20mL ddH₂O，35℃水浴40min。待酵母活化后，超净工作台中平板划线分离，28℃培养16h，挑取单菌落继续划线。从长有单菌落的平板中挑取具典型酵母菌落特征的接种于斜面华体会体育最新地址 ，并做纯度检查，直至获得纯培养体为止。最终以斜面保藏。

②酵母的计数

（1）以无菌生理盐水稀释活化后的酵母菌，制备菌悬液；

（2）用漩涡振荡器将菌悬液震荡混匀；

（3）取洁净的血球计数版，盖上盖玻片，将制备好的菌悬液从盖玻片的边缘沿缝隙滴入，利用渗透作用进入计数室，静置5min；

（4）使用血球计数板计数，计算公式：总菌数/mL=A/5×25×104×B=5000A×B（A为5个中方格菌总数，B为稀释倍数）。

③乙醇发酵

以水稻秸秆水解后还原糖为碳源，以固液比1:10加入发酵华体会体育最新地址 ，121℃灭菌20min。从斜面华体会体育最新地址 上挑取保存的酿酒酵母于种子华体会体育最新地址 中28℃、200rpm培养16h，以10%接种量接种。发酵pH5.0，温度30℃，取发酵24h、48h、72h、96h的产物进行乙醇含量检测。每组设立三组平行重复。

④乙醇含量的测定

• 乙醇标准曲线的绘制：

精确称取0.2000g无水乙醇，加去离子水定容至100mL配制成20mg/mL的标准溶液，然后按下表配成不同浓度梯度的乙醇溶液。

编号	乙醇浓度（mg/L）	乙醇标准液（mg/L）	重铬酸钾（mL）
0	0	0	2
1	0.2	0.1	2
2	0.4	0.2	2
3	0.6	0.3	2
4	0.8	0.4	2
5	1.0	0.5	2
6	1.2	0.6	2

加入2mL重铬酸钾溶液后，沸水浴10min，流水冷却至室温。利用分光光度计，测定并记录OD600。三次重复求平均值。以乙醇浓度（mg/mL）为横坐标，吸光（OD）为纵坐标绘制乙醇标准曲线。

（2）测定时将发酵产物加入去离子水，使其中的乙醇与残糖溶于30mL去离子水中，室温搅拌，使乙醇溶于去离子水中，经两层纱布过滤除去固形物，再置于离心机中4000rpm离心除去菌体。将标准乙醇溶液换成待测液，重复上述操作步骤。将得到的600nm处的吸光值带入乙醇标准曲线，计算得出乙醇量（g/L）。

未经允许不得转载：hth网页入口»水稻秸秆的乙醇发酵