PAT技术在细胞/微生物发酵工艺开发及生产中的应用

利用动物细胞反应器大规模培养生产疫苗和抗体是现代生物医药产业的重要组成部分，这些产品在疾病管控、治疗重大疾病当中的作用是不可替代的。在过去的几十年中，动物细胞及微生物发酵大规模培养技术已取得了长足的进步，相关产品的产量显著提高。

现代生物制药对产品质量和一致性提出了更高的要求。越来越多的过程研究工作致力于提高产品质量和一致性。而一致的工艺性能和 QbD 需要充分利用过程分析技术（process analytical technology, PAT）。

一：PAT的概念

过程分析技术（Process Analytical Technology, PAT）是以在线分析和化学计量学方法为核心内容。20世纪90年代以近红外光谱为代表的现代过程分析技术在石化等工业中得到了较为广泛的应用，显著的提高了经济效益和社会效益。2004年9月，FDA颁布了,旨在通过PAT技术实现对药品研发、生产和质量全过程更加科学的控制。PAT的主要目标在于提供可连续产生预定质量产品的过程。质量和效率的提高来自于：

1）使用on-line、in-line、at-line检测和控制，降低循环次数；

2）减少物料能耗；

3）产品即时放行；

4）提高自动化利用度。

图1 PAT概率（参考LAM和Kiss的概念，2007）

近20年过去了，PAT在制药工艺及生产上并未得到广泛应用，主要原因有以下几方面：

• 实时控制带来的效益未被领会和理解。
• 没有充分建立允许和促进变革的监管程序。
• 实施PAT在技术上还存在需要突破的地方

PAT的关键概念之一是，PAT不仅是一种监测方法，而且还是一种在过程周期内进行控制过程的方式，以实现目标产品质量。

生物制药公司一直在工艺理解上投入资源，以确保生产过程实现目标CQAs,在QBD运行中，使用PAT技术能够改进工艺。工业界和管理机构也认识到，影响产品质量和过程属性的因素有很多，但这些因素仍然没有被很好的理解。然而，工业界在过去几十年中不断获得的过程理解显著增加。从产品成本和制造能力的角度来说，提高过程生产率至关重要，但生物制品产品质量及其与药效和安全性的直接相关性是重组蛋白生产过程中的关键。

图2 传统控制模式和PAT控制模式的对比

二：细胞培养/微生物发酵主要工艺参数及控制

图3 典型的基于CHO细胞的抗体生产过程的流程图

通常，现行的细胞培养生产是分批补料工艺，即一定量的成分（比如葡萄糖、氨基酸、维生素等）被添加到华体会体育最新地址 中维持华体会体育最新地址 的多样性，保证特定产品的生产速率。生产工艺参数通常包括：搅拌、DO、pH、温度等。生产过程中，产品质量主要是由选定的细胞克隆和发酵工艺条件所决定的，纯化工艺对产品质量属性的影响较小，通常对电荷异构体分布、多聚体水平和杂质去除有影响的可能。制剂工艺在维持药物产品质量方面也是关键的，在这个阶段，抗体产物质量也可能会收到影响，例如蛋白氧化、脱酰胺或聚集。

表1 发酵过程中主要考虑因素

图4 细胞培养过程中的检测

表2 发酵过程中的新型传感装置

三：PAT工具在发酵过程中的应用及挑战

目前用于生物反应器中的在线传感器种类还不多，主要为pH、DO、温度、液位等有限几种。监控大多数细胞培养过程需要手动取样操作、样品制备以及一系列的离线测量技术来理解工艺性能。离线测量提供有限的理解和性能，因为只有少量零散的数据可用。几种传感器的灭菌和长期稳定性问题，使得重要分析物如葡萄糖、乳酸、细胞密度、铵根等在线检测受到限制。

3.1 在线pH测量

大量的研究已经表明，大规模哺乳动物细胞培养的最大变异参数可能是pH。基于在线pH传感器信号，通过增加碱或酸将培养物的pH维持在预定的设定点，是PAT应用的一个实例。已经有报道表明，在大规模的生产中，由于pH传感器信号的漂移导致产量的大量减少。因此需要理解和减小pH传感器的漂移，从而在扩大规模的过程中减少可变性。

在生物反应器运行中常见的假设是pH传感器信号的稳定。然后，开发和生产的经验并不能支持这种假设，这被通常在细胞培养过程中需要调整在线传感器以匹配离线值的实践所证明。pH电极一般会经过两个阶段：高压灭菌过程后的正漂移以及在细胞培养过程中缓慢的负漂移。在高压灭菌期间，玻璃膜外表面暴露于高压蒸汽，而pH传感玻璃的内表面恒定暴露于内部参比电解质，这导致对pH感应模块不同的影响。这些可以通过优化玻璃膜化学性质以降低高温高压灭菌的影响。另一种方法是改变灭菌过程。

3.2 近红外(NIR)光谱

NIR是一种可以为细胞培养过程中最重要分析物提供实时在线数据的技术。通过分析待测样品的NIR光谱，从而获得来自原位NIR传感器的化学信息。理论上来说，C-H、N-H、O-H和S-H共价键的伸缩振动和弯曲振动是产生近红外谱图的原因。pH或金属离子等离子化合物不会直接影响NIR光谱，但是它们可以间接影响NIR光谱。NIR传感器可以监控多个成分，从而无须同时使用多个传感器，光谱测量是非侵入式的，极少使用化学试剂，并且NIR探针可以在SIP探针可以在SIP中使用。因此，没有必要担心因灭菌和长期使用影响传感器稳定性。目前NIR光谱技术已经足够完善，在细胞培养生产过程中具有潜在应用。阻碍其在生物反应器中使用的主要问题是水分在1400nm和1800~2200nm有大量的吸收，这也是NIR的核心光谱区间。直到现在，由于NIR光谱中水分的过多吸收，导致从光谱中获取信息非常困难。

在细胞培养生物反应器中广泛实施NIR光谱之前必须解决几个挑战，包括提高运行之间的重复性，减少传感器和传感器、设备和设备之间的差异。建立NIR光谱模型需要大量的资源，维护这个模型仍是一个挑战。

3.3 在线细胞密度的测定

传统的离线方法如血细胞计数器、细胞计数器、琼脂板细胞计数，费力而耗时。新方法采用光学原理。细胞密度方法使用单频光源，基于光散射，而非吸收光。用于细胞密度的测定波长常为550 nm和650 nm,这两个波长主要与细胞有关，而与华体会体育最新地址 中溶解的组分相关性较小。市售的在线细胞密度传感器通常分为两类。第一类基于光学检测到光密度计数。第二类使用一个电容和电导测量。

3.4 在线溶氧测量

溶氧是细胞反应器中重要的控制参数，空气或富氧空气被供应到生物反应器以满足细胞氧需求。细胞利用氧气产生能量和生长。与需要严格控制的pH不同，溶解氧（DO）可以保持在更宽泛的操作条件下，而不影响细胞生长速率或产物质量。溶氧通常用两种主要类型的传感器测量：极谱法和光学法

3.5 在线葡萄糖测量

葡萄糖是细胞培养过程和发酵的主要碳源。细胞依靠葡萄糖生长和代谢产物。因此，检测和控制葡萄糖是非常重要的

3.6 知识管理工具：建模

建模可以应用于细胞培养的不同领域：

1）设备设计；

2）过程放大和缩小

3）过程优化；

4）实时应用。

从PAT的角度来看，实时模型是最重要的应用类型。这些模型使用实时数据来提高正在进行的过程的性能。该过程可以实时保证例如最大化滴度或最小化过程变异性以确保一致的产品质量。代谢通量方法是具有实时能力并具有内在生理过程知识的建模方法。该方法使用线性规划来求解一组质量和动力学方程，以确定细胞中产生或消耗的组分和代谢物的代谢通量。在工业上常见的是偏最小二乘（PLS）模型。然而，这些模型不适用于外推，不能为流程带来更多的了解，并且需要大量的数据集来构建。标准PLS模型可以用于一些类型的非线性过程，PLS变量还被用来捕获更多的非线性特性。PLS模型已经被用于产品产量和过程监控的在线预测。虽然文献表明了这种技术的可行性和好处，但在实践中，工业界需要在数据基础设施上做更多的工作以实现实时预测。

四：案例分享—拉曼光谱

虽然红外吸收光谱技术已经广泛地应用于制药行业，但其具有一定的局限性。与红外吸收光谱相比，拉曼光谱具有如下明显的技术优势：
①光谱分辨率更高，能给出更多的光谱细节，信息更加丰富；
②拉曼测试简单，不需要制样。红外需要制样，对于某些硬度高的样品，制样尤其困难；
③具有更好的共焦显微性能，空间分辨率达到亚微米级，可给出样品的精细化学组分分布图像；
④可在线原位分析；
⑤可更加直接的与多变量校正、回归分析结合，从而进行定量分析。

拉曼光谱分析法是基于印度科学家C.V.拉曼（Raman）所发现的拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。简言之：光学上在数秒钟之内收集一个分子的组成指纹图谱。

传统在线拉曼光谱已经存在市场多年，不过由于传统拉曼光谱检测限值较低，仅为10-100ppm，痕量物质分析困难，同时由于成本过于高昂，操作极其复杂，这些缺点阻碍了传统拉曼光谱技术在生物制药行业连续生产工艺的大规模应用。

4.1拉曼光谱仪测量培养液中的葡萄糖和乳酸

葡萄糖和乳酸，按照以下浓度制作标准曲线：0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 4.5 g/L

实验设置：5s测试时间，取24个测量值作为平均值。

实验结果显示：检测限:<0.1g/L，具有非常好的响应性和线性度

图5 拉曼用于葡萄糖及乳酸检测

4.2拉曼光谱仪测量培养液中的葡萄糖和乳酸

图6 拉曼用于抗体表达量检测

五：PAT展望

在单克隆抗体方法的开发和生产中，例如pH和溶解氧探针一类的在线和原位传感器已经在其他行业中应用多年。它们已经满足发展生物技术工艺的需要。然而，由于生物技术行业与其他行业的区别，需要具有独特的传感器技术来满足其需求。在线传感器具有高选择性、检测范围广、稳健性、满足无菌要求的能力和易操作性，这些将有助于开发、增加对过程的理解，作为PAT手段最终用于过程控制。

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