大肠杆菌（Escherichia coli）是目前在科学研究和工业生产中使用最广泛的基因工程菌种，虽然大肠杆菌基因工程发酵中的载体构建、宿主选择和目的基因的克隆合成已经有了成熟的方案，但是高密度发酵还存在很多问题。比如：大肠杆菌高密度发酵中的自溶问题一直困扰人们，而引起高密度发酵中大肠杆菌自溶的主要是噬菌体，同时也有非噬菌体引起的情况，这种不是噬菌体引起的大肠杆菌自溶现象，相关报道以及原因研究较少。

一、大肠杆菌细胞自溶机制

关于细菌细胞死亡和自溶现象方面的研究已经有近百年的历史， 1900s早期Sturges等将细菌生命周期最后阶段经历的自我结构降解过程定义为“细胞自溶”。对于细菌发生自溶现象进入衰亡期的研究主要经历三段时期:

（1）1900s早期研究者们将细菌生命周期最后阶段经历的自我结构降解过程定义为“自溶”，发现胞壁质水解酶和肽聚糖水解酶等“自溶素”催化水解细胞壁肽聚糖层，与自溶过程密切相关；

（2）1900s中期研究者普遍认为细菌培养条件可以诱导细胞自溶的发生如高温，氧气过量供应，葡萄糖过量， C源N源缺乏， pH，渗透压等；

（3）现在，越来越多的研究者发现大多数细菌细胞死亡及自溶的发生过程可能受类似于真核组织细胞凋零的程序性死亡机制调控，细菌死亡及自溶机制成为细菌生理学研究基础。

最新的研究发现，大肠杆菌内存在类似于真核组织细胞凋亡的程序性死亡 （ Programmed Cell Death， PCD）机制，调控细胞死亡及自溶的发生过程。

目前在已发现的五个感受和应对E. coli细胞胁迫(Stress)的信号传导途径Bae、Cpx、Psp， Rcs、和σ^E中，已明确的导致细菌细胞自溶的信号传导途径和发生过程主要集中在Sigma E(σ^E)途径。 σ^E介导的细胞自溶过程被认为是细胞在营养物缺乏或不良生存环境下的一种内在生存策略，主要用于去除“活着但不可培养” (Viable but nonculturablecell， VBNC)的细胞。

基于摇瓶培养的E. coli细胞由对数生长期进入稳定期后，细胞受发酵过程中的营养缺乏，或受培养液pH胁迫(pH stress)和氧化胁迫(Oxidative stress)等环境刺激，可以达到超过60%的细胞由“活细胞” (Viable cell)转化为VBNC细胞， σE介导的细胞自溶机制的启动用于清除这些VBNC，使得活细胞最大限度利用细胞释放物来应对营养缺乏环境以保持较长的细菌稳定期。

Murata等于2012年系统地阐述了一条完整的σ^E介导的细胞自溶途径，即当细胞受到pH、氧化(Oxidative stress)、温度(Heat shock)和营养物匮乏(Nutrient starvation)等环境胁迫时，未折叠好的周质蛋白在周质空间或细胞膜上积累诱发介导的自溶机制启动， σ^E蛋白在细胞质内被激活；假如损伤蛋白积累的量小，则被激活的蛋白水平也会较低，细胞则启动与蛋白修复相关的有关蛋白组的表达；如果损伤蛋白积累的量高到一定程度，那么活性σ^E的水平也会较高，细胞就启动σ^E的调节子sRNA-MicA和RybB的基因转录，然后通过这两个sRNA与同源mRNA的相互影响以及核糖核酸酶的降解作用降低OmpA.OmpC和OmpW等外膜蛋白的mRNA水平，进而减少这三个膜蛋白的表达，导致外膜缺陷，引起细胞的自溶。

这是迄今为止第一个完整地描述在细胞程序死亡上的细胞自溶的信号传导和过程机理的结果(如下图所示)，毋庸质疑其它感受和应对E.coli细胞胁迫的信号传导途也有可能参与细胞自溶的发生与进展，但是目前尚缺乏普遍认可的系统描述。

在E. coli细胞中σ^E介导的细胞自溶模型

二、发酵过程中大肠杆菌自溶的现象

1、发酵罐中菌体自溶现象：有泡沫形成（停止搅拌后泡沫经久不散），加入消泡剂无效，OD快速下降，pH上升，溶氧上升，发酵液拉丝，镜检可见碎片，发酵液味道异常。

2、细胞自溶过程： (1)细胞自溶会释放出胞内蛋白酶到培养液中;(2)还会释放胞内未完成信号肽自剪切的目标分子前体和释放细胞周质空间中未完成正确折叠的蛋白分子; (3)细胞自溶将释放核酸分子进入培养液,显著增加发酵液的粘度,导致下游超滤和柱层析分离过程的困难; (4)过早发生的细胞自溶会显著降低细胞对目标蛋白的批式表达水平一罐批生产率下降。

三、发酵过程中引起大肠杆菌细胞自溶因素

1噬菌体及染杂菌引起的菌体自溶

由噬菌体引起的菌体自溶原因，处理办法请详见hth网页入口 网：发酵工艺：发酵过程中感染噬菌体的特征、防止方法、处理手段最全分享；发酵分析：噬菌体（phage）对细菌类发酵生产的影响；发酵分析-发酵过程中的噬菌体相关问题

2 非噬菌体引起的菌体自溶

（1）代谢产物（如多粘菌素）

有研究发现，在多粘菌素B Sub-MICs导致大肠杆菌自溶的研究中，对自溶环上的细菌进行了动态观察，可见随着培养时间延长，细菌淡染程度加重；以活菌计数法观察到活菌数量的下降；用透射电镜观察到细菌胞壁不完整或全部破损，内容物流失，确证了多粘菌素BSub-MICs诱导大肠杆菌形成的溶菌环上的细菌发生了自溶。

（2） 外源蛋白质表达与大肠杆菌宿主自身的胁迫应激机制

在生物反应器中表达ScFv大肠杆菌细胞自溶的分析中发现，外源蛋白高效表达并积累在细胞内，大部分活细胞较野生菌提前6h进入活着但不可培养（VBNC）状态，进而发生细胞自溶。分析工程菌与野生菌中胁迫应激和自溶途径基因转录水平表达谱，发现外源蛋白表达过程中热激途径rpoH，dnaK，dnaJ，groEL，groES；酸胁迫途径 rpoS，gadE，gadX；氧胁迫途径sodA，katE 均出现表达波峰，而发酵罐中细胞自溶过程中外膜蛋白基因 ompA， ompC，ompW，ompX表达量显著下降，但rpoE并未出现持续高表达，验证了外源蛋白质表达与大肠杆菌宿主自身的胁迫应激机制（热胁迫应激、酸胁迫应激途径、氧胁迫应激途径）和自溶机制之间的关联。

（3）接种量与补料速率

饶犇等在大肠杆菌大规模发酵谷氨酸氧化酶中菌体自溶性的研究中，发现接种量超过2%就会对大肠杆菌发酵产生不利影响，使得发酵结束时菌数降低，超过5%后发酵液中菌体基本全部自溶；补料速率也是一个重要的影响因素，补料速率太快会导致菌体生长过快，从而营养不足，导致菌体逐渐自溶。

（4）华体会体育最新地址 的碳氮源比

由于碳氮比不合适引起的自溶、碳源不足，引起细胞过早的衰老。

（5）菌体老化及保存不当

在发酵过程中菌体生长比较缓慢，且菌体自溶的过程也比较缓慢，做革兰氏染色时发现菌丝细长不分裂。

大肠杆菌是研究和工业化生产中使用最为频繁的工程菌种，有许多优点，如生长快、外源蛋白表达量高等。但我们更不能忽略染菌如噬菌体感染，发酵过程温度pH，溶氧，接种量，补料等发酵条件的影响，避免菌体自溶，给工业发酵带来巨大的损失。

四、发酵过程中菌体自溶的改进策略

1、做噬菌斑实验（双层平皿法）或用电镜观察。确定噬菌体感染的原因。种子侵染，需要重新克隆菌种；华体会体育最新地址 感染可换另外的菌种实验；发酵罐空气过滤器感染，需要换过滤器且对发酵罐及环境进行化学消毒。另外侵染噬菌体需要停止发酵，并对发酵环境、物料做全面的清洁灭菌处理。
2、如果是由于补料碳氮比不合适引起的菌体自溶，要进一步优化华体会体育最新地址 配方。
3、如果是菌体传代时间过长或保存方式不当引起的菌体自溶，需要重新克隆新的菌种。
4、接种量不宜过大，大肠杆菌接种量大于5%时，大肠杆菌生长过快，在发酵进入对数后期，可能会存在菌体大量裂解的情况。
5、分析工程菌的代谢途径及代谢产物，对菌株进行进一步的改造。

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