制药行业活性物质提取中应用最为广泛的层析技术是离子层析，离子层析是目标物质和带相反电荷的介质以静电力的作用结合，然后在用高离子或改变pH的方式进行洗脱。特别要注意，蛋白的pI表征的是蛋白表面的净电荷，然而离子交换层析时是蛋白的局部电荷和介质作用，另外离子交换介质吸附的一类物质，如阳离子交换介质吸附带正电荷的物质，所以在纯化过程中，需要配合层析过程进来合理的结合及洗脱过程，才能达到预期的结果。本文总结了一些离子层析中常见的问题及解答，希望能对各位同行有所帮助。

问：我是用DEAE-Sepharose FF自己填充的玻璃柱，请问DEAE-Sepharose FF使用一次之后可以直接用第二次吗？中间要怎么再生处理呢？

答：可以用的，先用0.5mol/l氢氧化钠溶液冲三遍柱子，将填料弄出，用蒸馏水洗至中性。

问：色素沉积在层析柱中，对层析过程有影响吗？层析柱每次用完都需要CIP清洗吗？

答：色素沉积在层析柱中，不仅对其分辨率，收率有影响，更严重影响其使用寿命。

层析填料使用过程中是否需要每次使用后都要对其进行CIP清洗，取决于样品的属性，如若用在精纯阶段，并非每次都需要CIP清洗，如若用在捕获阶段，样品杂质很多且杂质成分复杂，每次层析后层析柱污染都比较严重则需要每次都CIP。

问：层析柱反压升高怎么办？

答：首先将层析柱和层析系统断开，检查层析系统（检测系统及系统管路）的背景压力是否升高，在确保层析系统无异常的情况下在对层析柱进行CIP。若CIP进行过程反压太高，难以进行，此时就要拆柱，拆柱后查看曾希祖上筛网的状态，进行超声清洗或者更换上筛网。若出现板结现象，拆柱倒出填料，进行清洗，比在位CIP有更好的清洗效果。

更多请参考下表：

问：怎么选择离子交换层析的层析柱？

答：用Tris-HCl还是PB，选择的依据是蛋白质的稳定性和活力在哪个缓冲液中好，浓度一般10-50mM，但是缓冲液应与样品缓冲液有相同的pH和离子强度。

问：目标蛋白洗脱不下来或洗脱下来的蛋白量较小怎么办？

答：a. 洗脱强度不够：增加洗脱的离子强度

1. 目标蛋白在洗脱过程中发生聚集沉淀：优化洗脱条件
2. 发生非特异性结合：优化层析条件
3. 填料载量太低：更换合适的层析填料

问：洗脱峰出现拖尾现象是什么原因？

答：a. 洗脱强度不够：增大洗脱强度

1. 柱子装的均匀：重新装柱
2. 柱床上端液面太高：柱床上端液面控制在0.5cm以内。

问：提纯的目标产物纯度较低，是什么原因导致的？

答：a. 样品复杂或者前处理不到位：层析前离心或过滤处理样品，或者优化层析体系，选择合适的离子交换填料和层析体系（缓冲液）

1. 样品粘度态高：用缓冲液适当的稀释样品，或者选择高分辨率填料（如SP-HPR等进行优化，降低上样量等尝试优化。
2. 清洗不彻底：增加清洗的柱体积数
3. 洗杂不彻底：优化洗杂的条件，增加洗杂的柱体积数
4. 目标物出现降解：优化层析条件，选择合适的层析条件或者添加蛋白稳定剂等
5. 柱料装填效果不佳：装填的不均匀，柱效低，重新装柱
6. 分离柱顶部有较大的储样体积：装柱避免分布器离柱料上层液面太高，应保持在0.5cm高度以内。
7. 洗脱条件不佳：优化洗脱条件，比如缓慢的拉盐梯度洗脱
8. 填料分辨率下降：对填料进行清洗或者更换填料。

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