一、补料分批发酵的定义及优缺点

补料分批发酵(fed-batch culture，FBC)：又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜华体会体育最新地址 的培养方法，是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式，是一种控制发酵的好方法，现已广泛用于发酵工业。

1.优点：

（1）推迟菌体自溶期，延长产物分泌期，维持较高的生产速率，提高产量。

（2）解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏；

（3）避免一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影响，改善发酵液流变学性质；

（4）可提高发芽孢子的比例，控制细胞质量；

（5）不需要严格的无菌条件，产生菌不易老化变异，比连续发酵适用广泛。

2.缺点：

补料使工艺复杂化，而且增加了染菌机会。因此工厂管理十分重要，一定要严格消毒，包括补充料液的消毒和管道消毒。

二、补料分批发酵的意义、原则及原因

1.意义

1.1可以控制抑制性底物的浓度高浓度营养物抑制微生物生长：

（1）基质过浓使渗透压过高，细胞因脱水而死亡；

（2）高浓度基质能使微生物细胞热致死 (themal death)，如乙醇浓度达10%时，就可使酵母细胞热致死；

（3）有的是因某种或某些基质对代谢关键酶或细胞组分产生抑制作用，如高浓度苯酚(3%~5%)可凝固蛋白；

（4）高浓度基质还会改变菌体的生化代谢而影响生长等。有的基质是合成产物必需的前体物质，浓度过高，就会影响菌体代谢或产生毒性，使产物产量降低。

1.2解除或减弱分解代谢物的阻遏

（1）有些合成酶受到迅速利用的碳源或氮源的阻遏，如葡萄糖阻抑纤维素酶、赤霉素、青霉素等多种酶或产物的合成。通过补料来限制基质葡萄糖的浓度，就可解除酶或控制菌的生长速率以及培养中期的代谢活动，延长合成期，推迟菌体自溶。

（2）加入前体增加合成产物的中间体，从而使产量大幅度提高。其产物的阻遏，提高产物产量。在植物细胞培养中，也采用该技术来提高产量。

1.3可以使发酵过程最佳化

分批发酵动力学的研究，阐明了各个参数之间的相互关系。利用FBC技术，就可以使菌种保持在最大生产力的状态。随着FBC补料方式的不断改进，为发酵过程的优化和反馈控制奠定了基础。随着计算机、传感器等的发展和应用，已有可能用离线方式计算或用模拟复杂的数学模型在线方式实现最优化控制。

2.原则

控制和引导产生菌在培养过程中，特别是中后期的生化代谢活动向着有利于产物积累的方向发展。根据菌体生长代谢规律；生产需要；环境条件

3.原因

（1）中后期营养不足，菌体过早衰老；

（2）初始华体会体育最新地址 营养过于丰富造成菌浓过大而缺氧；

（3）初始华体会体育最新地址 中葡萄糖过多引起抑制；

（4）代谢后碳氮源不平衡、微量元素缺乏；

（5）合成产物或中间产物积累的毒性。

三、补料内容

1.补充微生物所需的能源和碳源物质

发酵过程中，能源是从主要碳源来的。碳源是菌体需要量最大的物质，在发酵前期消耗很快，到了产物合成阶段菌体要维持活性必须补充碳源，以便延长产物合成期。

如添加葡萄糖、甘油、液化淀粉、饴糖；作为消泡剂的天然油脂，同时也起到补充碳源的作用。

2.补充微生物所需的氮源

补氮是发酵控制的另一个重要项目，主要作用是调节pH和补充产生菌所需的氮源，从而控制代谢活动。生产上补氮有两种：补充有机氮源补充无机氮源：通氨、补硫酸铵

（1）补充有机氮源添加某些具有调节生长代谢的有机氮源，如尿素、酵母粉、蛋白胨、玉米浆，保持菌的活性，补充产物合成所需的氮源。有时与碳源一起配合补料，工厂称作补混合料。

（2）补无机氮源A

通氨是某些抗生素提高产量的有效措施，它的作用是补充无机氮源和调节pH。通氨一般使用压缩氨气或氨水(20%)采用少量间歇添加或自动流加，由空气管道流入与发酵液均匀混合。氨浓度控制通过测定氨的比消耗速率，菌的比生长速率，产物比合成速率和pH来控制补加速率。

3.补前体添加前体

补前体添加前体显著增加产量、控制发酵方向。

4.补水、无机盐和微量元素

当发酵液过于粘稠时补水或补稀料可以稀释，发酵液，增加氧的溶解度，提高供氧能力。有些金属离子特别是二价阳离子是酶的激活剂，适当时间补入无机盐，可以提高酶活，从而提高产量。

四、控制策略

1.补糖控制考虑：

补糖时间、补糖量、补糖方式参考数据：糖耗速率、残糖浓度、pH变化、菌体浓度、菌丝形态、发酵液黏度、溶氧浓度等。一般选择其中两到三个参数来考虑。常用的两个参考指标：还原糖水平和总糖水平。

1.1补糖时间控制

补糖时间控制很重要，过早会刺激菌体生长，加速糖的消耗，不利于合成产物；过迟所需能量供应不上菌体已老化，合成产物的能力本身都很低了。

1.2补糖量的控制

补糖量的控制以控制菌体浓度不增或略增为原则，使产生菌的代谢活动有利于产物合成。一般在补糖开始阶段控制还原糖在较高水平，以利于产物合成，但高浓度的还原糖不宜维持过久，否则会导致菌体大量繁殖影响产物的合成。一般还原糖水平维持在0.8~1.5%之间较为合适。

2.补氮控制

补氮时间、补氮量、补氮方式根据氮消耗速率、菌浓度、发酵液粘度、pH决定补料的时间和补料的量。补充黄豆饼粉、酵母粉一般采取分批补料，而无机氮源和尿素一般采取流加方式，因为这些氮源对pH的影响大，而且过多的氨离子会对菌的生长产生抑制作用。

补入碳源还是氮源以及它们的量多少要根据产物的分子结构及细胞组成来决定。有的发酵氮源很低时也不需补氮源，是因为产物分子中几乎不含氮。当同时需要补充碳源和氮源时，可以混合起来一起加入。补料浓度的确定可以以摇瓶的基质残留浓度为依据进行试验。

五、补料方式

补料方式可分为：连续流加不连续流加(少量多次、大量少次)多周期流加连续流加效果最好，可以避免因一次大量加入引起环境突然改变给菌体代谢带来的影响。每次流加又可分为：快速流加、恒速流加、指数速率流加、变速流加。从补加营养物成分来看，又有单组分补料和多组分补料。

1.恒速流加培养

在培养过程中以恒定的流速加入葡萄糖好处：解除了底物抑制--葡萄糖阻遏效应，结果延长了菌体的生长周期，增加了菌体浓度和产物产量。

2.指数流加补料方式

理由：恒速流加，由于葡萄糖流加的速度始终恒定，在发酵的前期菌体浓度低，葡萄糖难以完全消耗，而到发酵后期，菌体浓度很高，但葡萄糖又不能满足菌体生长的需要，导致产物合成增加很少。指数流加方式可克服恒速流加的这一缺点。指数流加根据菌体的生长呈指数增加，它能够使反应器中营养物浓度控制在较低的水平，而使菌体浓度呈指数增加。

3.恒pH补料分批培养模式

根据华体会体育最新地址 pH的变化流加40g/L的葡萄糖。由于葡萄糖的分解变成小分子酸使pH下降，当pH降低到一定程度后，加入碱液调节pH达到设定的数值。然后随着糖被消耗越来越少， pH又会升高。再根据糖的消耗加入适量的葡萄糖，当pH下降到一定程度后，又加入适量的碱液调节pH。如此反复，发酵液中始终保持在较低的葡萄糖浓度。至60h流加结束，72h发酵结束。

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