近年来宠物市场快速发展，对兽用重组蛋白类药物的需求也愈加迫切。目前兽用重组蛋白的表达宿主主要为大肠杆菌，其存在目的蛋白产量低、可溶性差、保存期短、蛋白纯度低、内毒素或变性剂残留等问题，亟待引入高效表达平台弥补上述不足。新型无抗化毕赤酵母表达平台利用独有的抗性自消除系统，可以实现不限轮次的基因整合。基于该平台已将40余种重组蛋白（如CSFV E2抗原、犬α干扰素、纳米抗体、植酸酶、胶原蛋白等）实现1g/L以上的高效分泌表达。酵母表达具有产物易纯化、可溶性好、产量高等优点，可助力兽用重组蛋白药物的研发。

一、重组蛋白易纯化、易验证功能

分泌表达是毕赤酵母常用的表达方式。由于宿主自身的分泌蛋白较少，重组蛋白在发酵液上清中的比例可达极高水平。据经验，当产量达到1g/L时目的蛋白可占胞外总蛋白的90%以上，大幅降低了下游纯化难度。另一方面，由于杂蛋白较少，发酵液上清经过滤除菌后即可上细胞进行功能验证，可省略大部分实验室阶段的各种蛋白纯化工作。最后，对酵母发酵液上清进行层析纯化的成功率可达95%以上，不会出现大肠杆菌中“有表达但不能挂柱”的情况。

二、重组蛋白可溶性好、生物活性高、保存期长

酵母作为真核生物具有翻译后修饰机制，重组蛋白可在酵母内质网中发生一系列蛋白重折叠、二硫键异构等活动，从而形成正确的空间构象。此外酵母还具有 “质量控制”系统，未折叠或错误折叠的蛋白将被靶向至ERAD等降解途径，从而保证每一个分泌到华体会体育最新地址 中的蛋白分子都处于正确折叠的状态，从而保证其具有正常的生物活性。另一方面，正确折叠的蛋白会减少疏水基团的暴露，从而避免因分子碰撞而发生蛋白聚集，进而延长其保存期。

三、重组蛋白产量高

未经优化的酵母表达产量较大可能低于大肠杆菌。但通过使用高效表达元件、提高目的基因拷贝数、共表达分子伴侣后，重组蛋白的产量可比优化前提高3-8倍。最后通过使用高密度发酵技术，又可在此基础上继续提高8-10倍，最终将重组蛋白产量提高至理想水平。如图1所示，仅使用多拷贝技术，犬α干扰素的摇瓶表达量即可达到350 mg/L左右（图1A，泳道4，转化子含有6拷贝目的基因）。按照普通发酵方案将该菌株进行5L发酵罐表达，重组蛋白产量即可达到1.26 g/L水平（图1B，发酵参数未优化）。

图1 多拷贝策略对犬α干扰素产量的影响

(A) 摇瓶发酵上清的SDS-PAGE检测。泳道M，蛋白质分子量标记；泳道1-5：1、2、4、6、8拷贝酵母转化子发酵液上清。 (B) 6拷贝酵母转化子的高密度发酵。红色圆点：目的蛋白含量；蓝色方块：菌体湿重。

四、无有害物质残留

只要酵母发酵过程中不污染革兰氏阴性菌，其表达产物无内毒素残留。另一方面，酵母表达的重组蛋白可溶性好，无需变性-复性操作，故其纯化过程不会引入尿素、去污剂等有害物质，易通过相关验收。

五、酵母具有糖基化修饰机制

糖基化侧链对重组蛋白药物的影响是多方面的。首先，糖基化侧链具有较高的亲水性，同时可能“遮蔽”附近疏水性较强的区域，从而提高蛋白溶解度。部分蛋白经去糖基化处理后疏水氨基酸暴露，易发生沉淀。另一方面，糖基侧链可能提供合适的空间位阻，促使二级结构之间保持一定距离，从而形成正确的活性中心或暴露关键位点。最后，酵母的糖基侧链结构与哺乳动物确实存在差异，有遮蔽关键互作位点或提高免疫原性的潜在风险。因此进行蛋白药物设计时需要相关实验佐证。

基于新型无抗化毕赤酵母表达平台，本团队对蛋白药物开发做出如下规划：利用结构生物学、生物信息学相关技术定位细胞因子与受体互作的关键位点，设计突变方案对这些位点进行定向进化，以期提高细胞因子与受体的亲和力；利用酵母分泌表达的特性，验证发酵液上清中不同突变体的生物活性；筛选到高活性突变体后，通过融合高糖基化标签、血清白蛋白提高重组蛋白分子量，进而降低肾小球滤过，提高重组蛋白半衰期；利用多拷贝、分子伴侣、高密度发酵等技术，实现重组蛋白高效分泌表达。最终获得高效、长效、高产的重组蛋白药物。

欢迎感兴趣的企业莅临江苏省农业科学院考察交流。

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作者简介：李丁，博士，助理研究员，长期从事酵母表达及优化工作，近年来发表SCI论文3篇，主持江苏省博士后基金一项（《重组猪瘟病毒E2 蛋白的细菌样颗粒疫苗的构建与表达菌株优化》，项目批准号：2018K171C），主持国自然青年基金一项（《酵母分泌途径改造影响猪瘟病毒E2蛋白表达的分子机制研究》，项目批准号：32002316）。

联系方式：19961869573（微信同号）。

单位简介：江苏省农业科学院动物免疫工程研究所（以下简称“免疫所”），拥有“国家兽用生物制品工程技术研究中心”和“农业部兽用生物制品工程技术重点实验室”等国家级平台，于“十二五”和“十三五”期间获国家授权专利102项，PCT专利4项；获国家一类新兽药注册证书2个，二类证书1个、三类证书9个。免疫所现有科技人员50余人，其中高级职称20余人，博士学位20余人，涵盖微生物学、预防兽医学、细胞生物学、生物化工、分子生物学等基础专业人才，具有分子生物学实验室、细胞培养间及实验动物房，具备从分子水平、细胞水平和动物个体水平进行生物学研究的各种实验条件。

通信地址：江苏省南京市钟灵街50号，江苏省农业科学院动物免疫工程研究所。固定电话025-84392018

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