一、冷冻干燥管的选择与清洗

冷冻干燥管一般买用耐温度骤变，耐压，管壁厚冷均一并且为中性玻璃的安瓿管。管的内径为8mm左右，长度不小于100mm。清洗安瓿管时，先用2％盐酸浸泡过夜，然后用自来水冲洗3次以上，最后用蒸馏水冲洗、浸泡至pH中性，然后干燥。

1.1标签的准备

保藏菌种的标记方法有很多种，一般分为管外侧标记和管内标记网种。

管外侧标记常用以下两种方式：

①采用标签机直接在安瓿管上打印菌种编号、保藏日期，大小为1cm x3cm左右。

②将胶布剪成1cm宽、3-4cm长的小条，在上面填写菌种编号、保藏日期，贴在安瓿管外。

管内标记法：选择滤纸或吸水纸（大小为1cm ×3cm左右）记录菌种的编号、保藏日期，然后装人安瓿管内。

1.2保护剂的选择和准备

保护剂用来减少冷冻干燥引起的微生物细胞的损伤。保护剂的选择与配制因所保藏的菌种的不同有所变化。配制保护剂时应注意保护剂材料的搭配、保护剂的浓度及pH（一般保持中性)。常用的保护剂为脱脂乳。一般微生物保存常用的保护剂参见附录B《常用保护剂》。厌氧微生物冷冻千燥所用的保护剂在使用前应在100°C的沸水中煮沸15min左右，脱气后放人冷水中急冷，以除掉保护剂中的溶解氧。

二、菌种的准备

2.1菌液的准备

在所保藏菌种的最适培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检杳后与保护剂混合均匀，分装。

①用斜面培养物制备菌液，取1~2ml保护剂，加到试管斜面培养物上，用较长的滴管轻轻涂擦斜面，制备均匀的细胞悬液，注意不宜泡沫过多或刺挖琼脂。然后尽快分装到安瓿管中。

②用液体培养物制备菌液，离心收集液体培养物中的菌体，弃去上清液，加人保护剂（每毫升培养物加1~2ml)。将培养物与保护剂混匀，分装安瓿管。此方法适用于冷冻干燥和低温冷冻法。

2.2其他方法

培养物在平皿培养形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取大小均匀的直径约5~10mm的菌块（对真菌来说，最好取菌落边缘的菌块），与保护剂泥匀后加人安瓿管或冻存管内。此方法适用于低温冷冻法。

三、分装与加棉塞

分装菌液应在无菌条件下操作。采用较长的滴管，直按将菌液滴人安瓿管或冻存管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1~0.2ml。若是球形安瓿管，装量为半个球部。一般2~2.5ml菌液可以分装10~15个安瓿管。分装后用脱脂棉堵住安瓿管管口，注意不要过紧或过松。分装时间尽量要短，最好在1~2h内分装完毕并预冻。

3.1预冻

一般预冻2h以上，温度达到一40°C左右。目前常用降温方法有以下三种：

①程序控温降温法。应用程序控制降温仪，可以稳定连续降温，能很好地控制降温速率。

②冷冻干燥机自行冷冻。某些冷冻干燥机具有冷冻功能，在真空泵不开启的情况下，可将菌种冷冻到一40°C左在。

③将菌种放人一80°C冰箱预冻。预冻速度控制在每分钟下降1°C，使样品冻结到一35~-40°C。

3.2冷冻干燥

采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。将预冻后的样品安瓿管迅速置于已充分预冷的冷冻干燥机样品舱内，关闭放气网，打开真空泵开始冷冻干燥，接近干燥完成时，适当升温(按冷冻千燥机的具体要求进行操作)，确认冷冻干燥完毕后，缓慢打开放气阀，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。冷冻千燥时间一般为8～20h。

判断冷冻干燥已完全的指标：①安瓿管内冻干物呈酥松块状或松散片状。②真空度接近空载时的最高值。③冷冻干燥机显示的样品温度与舱内温度接近。④蒸馏水对照管中的水分已完全挥发掉或1%～2%氯化钴的对照管已呈深蓝色。

3.3安瓿管封口及真空检验

从干燥器中取出冷冻干燥完全的安瓿管，在距管口5cm左右用喷射火焰(喷灯、焊枪等）将安瓿管拉细，然后将安瓿管口连接到与真空安瓿管泵相连的橡皮管上，打开真空泵，在真空条件下（一般真空度达到0.001托），用喷射火焰对准安瓿管细颈部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪检测真空度。

四、保藏

封口完全的冷冻干燥管应低温避光保藏，一般在封口后1天、7天、30天随机抽取若干支冷冻干燥管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、部分丝状真菌和酵母菌等的保藏，但不适用于藻类和原虫等的保藏。不同微生物的保藏周期不同，一般在10年左右。

五、复苏方法

5.1冷冻干燥菌种的复苏方法

先用70%酒精棉擦拭安瓿管的上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾灭菌水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用锉刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端。或直接用玻璃刀划开用灭菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜华体会体育最新地址 ，进行培养。

5.2低温冷冻菌种的复苏方法

从一80°C冰箱或液氮罐中取出安瓿管或冻存管，立即放置在38~-40C温水中快速复苏并适当摇动，直到内部结冰全部溶解为止，一般需50～100s。在无菌条件下开启安瓿管或塑料冻存管，将管内保藏物接种至适宜的华体会体育最新地址 上进行培养。

以上方法适用于普通微生物菌种的冷冻干燥。对于厌氧微生物、病原微生物等菌种的冷冻千燥流程与前面方法相似，但是在菌种的准备、复苏等环节稍有差异。操作过程应注意生物安全防护。

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