影响酵母表达系统外源蛋白表达水平的因素及解决办法

甲醇酵母表达系统的优点：它是一种真核表达系统，可对表达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰；具有高的表达量；节省成本，只需简单的含盐华体会体育最新地址 即可；适合于高密度培养；背景杂蛋白少，表达产物较易纯化。

1外源基因序列的内在特性

为了获得最佳蛋白表达量，应维持外源基因mRNA 5-UTR尽可能和AOX1 mRNA 5'-UTR相似，并且最好是保持两者一致。此外， 5UTR中应避免AUG序列以确保mRNA从实际翻译起始位点开始翻译，并且可以通过密码子的替换使起始密码子AUG周围不形成二级结构。(A+T)含量高的基因在甲醇酵母中表达时有时会造成转录提前终止，因此，对(A+T)含量丰富的基因，最好是重新设计序列，使其(A+T)含量在30%~55%的范围内。

外源基因在宿主中的表达会受到酵母偏爱的密码子的影响，通过对外源基因的密码子进行优化可以提高其表达水平。

2.基因拷贝数

一般情况下，甲醇酵母中外源基因整合的拷贝数愈高，则蛋白表达量愈大。事实上，高的基因拷贝数和高的蛋白表达量之间并无必然的联系。因此，有必要在筛选出高拷贝转化子鉴定表达的同时，也显示出单拷贝转化子作为对照，比较两者的表达量。

3·菌株的表型

外源基因转化甲醇酵母后，能够整合到染色体上。整合的不同方式会导致转化子的两种表型。一种方式是插入，即整合后AOX1基因是完整的，没有被破坏掉。这样转化子代谢甲醇的能力正常，能在甲醇华体会体育最新地址 上正常生长，这种表型称为Mut，另外一种方式是替换，即整合后外源基因取代了受体菌染色体上的AOX1基因，造成AOX 1基因的丢失。这样转化子代谢甲醇的能力很弱，在甲醇华体会体育最新地址 上生长很慢，这种表型称为Mut so对于胞内表达蛋白，优先考虑用Muts表型。因为它们有一个低水平的乙醇氧化酶蛋白，表达的蛋白更容易纯化； 对于分泌表达，则Mutt和Mut s都可使用。

4、分子伴侣

分子伴侣在细胞内帮助其他蛋白完成正确的组装但不参与这些蛋白所行使的功能，在组装完成后即与之分离。大量的研究报道，分子伴侣与靶基因共表达可显著提高靶蛋白的表达量。

5信号肽

在毕赤酵母中重组蛋白分泌到胞外必须经过信号肽的引导，由于信号肽与目的蛋白融合表达，从而使目的蛋白在加工折叠后被引导分泌到胞外。常用的酵母信号肽有a因子信号肽(MF-a)、酸性磷酸酯酶信号肽(PHO1) 、蔗糖酶信号肽(SUCZ) 、Killer毒素信号脉和菊粉酶信号肽(INU)等。

糖基化修饰

研究表明，通过对糖基化位点进行改造或引入新的糖基化位点可提高分泌蛋白在毕赤酵母中的表达量及重组蛋白的活性。

发酵工艺

高密度发酵是提高毕赤酵母重组蛋白表达量的一种重要策略。毕赤酵母表达外源蛋白时，温度、pH、碳源、溶氧等培养条件对目的蛋白的完整性及产量都有较大的影向，优化培养条件可有效提高外源蛋白的表达量。对华体会体育最新地址 的优化主要包括碳源的优化、氮源的优化、基础盐和PTM1微量盐的优化。有多种华体会体育最新地址 ，如BMGY/ BMMY、BMG/BMM， MGY/MM等都可А来表达BMGY/BMMY、BMG/BMM华体会体育最新地址 成分中含有缓冲液，常用来表达分泌蛋白，可在一个广泛的范围内获得最佳的蛋白产量，尤其是当pH值对外源蛋白活力很重要的情况下。甲醇浓度对目的蛋白的表达起着重要的作用，诱导期间华体会体育最新地址 中每天应补加甲醇，以弥补甲醇的消耗和蒸发，一般每天添加到华体会体育最新地址 中的甲醇含量为华体会体育最新地址 体积的0.5%。毕赤酵母可以在较宽泛的pH范围内表达外源蛋白，因此可以通过调节pH值抑制蛋白酶，使降解程度减至最低，提高外源蛋白的产量。此外，在华体会体育最新地址 中添加1%酪氨酸蛋白水解物也可减弱蛋白的降解作用。一般发酵罐较摇瓶培养表达量更高。这是因为在发酵罐中，溶解氧水平、通气量、pH值、搅拌速，率、营养补给等方面更容易得到优化，导致更高效的表达。

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