补料发酵（Fed-batch Fermentation），指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加含有限制性营养成分的新鲜华体会体育最新地址。早期的补料方式完全是凭经验进行的，即发酵到一定时间，经验性地添加一定量营养物。补料成分简单、补加的数量少，这种补料方式简单易行，但往往无法有效控制发酵。

在现代大规模发酵工业中，补料方式已从简单一级补料发展到多级重复补料，从简单地补加一种营养物发展到补加几种营养物。补料发酵类型也更加多样化。

1.补料发酵方式

（1）发酵类型按补料方式分：有连续补料、不连续补料和多周期补料；

（2）按补加物料的组分分，可分为完全补料（补入完全的华体会体育最新地址 ）和半分批补料(补入一种或几种营养成分)；

（3）按补料控制方式分，有反馈控制补料和无反馈控制补料。反馈控制补料还可分为直接控制补料和间接控制补料；

（4）按反应器数目分，有单级和多级之分；

（5）按反应器中发酵液体积变化分，有变体积补料和恒体积补料。

2.补料的营养物质分类

补料一般是在发酵进行至大量生成产物的阶段，因合成产物和维持细胞活动的需要，有选择地补充营养物质。合适的补料工艺能够有效地控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。补料发酵补加的营养物质大致有五类：

（1）补充菌体所需的能源和碳源，如葡萄糖和液化淀粉等；

（2）补充菌体所需氮源，如蛋白胨、豆饼粉、玉米浆、酵母粉和尿素等有机氮源，有些发酵还采取通入氨气或添加氨水等；

（3）加人某些菌体生长代谢所需的微量元素和无机盐，如磷酸盐、硫酸盐等；

（4）对于产诱导酶的微生物，常在补料中适当加入该酶的作用底物，以提高酶的产量；

（5）对一些抗生素发酵，往往需要补充抗生素形成的前体。

补料发酵中添加的各种营养物质

3.补料发酵工艺的优点

（1）有利于菌体的高密度培养

高密度发酵的生物量可达60~150g/L，需投入2-5倍于生物量的营养物。所以，若将所有的补料一次加到华体会体育最新地址 中，过高浓度的营养物势必造成菌体代谢的紊乱，表现为迟滞期延长，比生长速率降低，得率下降。每种营养物都会有一个极限值，如铵盐5g/L，磷酸盐10 glL，葡萄糖100 g/L，要使微生物始终处于适宜生长的环境条件和达到高菌体浓度，必须采用恰当的补料方式。

（2）降低华体会体育最新地址 中有毒底物对菌体生长的抑制

有些发酵需要利用甲醇、醋酸和苯酚等有毒物质作为华体会体育最新地址 成分，这些物质即使在较低浓度下，也会对微生物生长产生抑制作用。而通过补料，可减小抑制作用。例如，苯乙酸钠是青霉素G生物合成的前体，但它对产黄青霉有毒性且易被菌体氧化。生产上可采取少量多次或连续地补加低浓度的苯乙酸钠，使它在华体会体育最新地址 中的浓度维持在0.08%~0.1%，保证菌体正常生长和青霉素发酵。

（3）解除高浓度营养物和分解代谢物引起的阻遏作用

葡萄糖分解代谢物可阻遏包括纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、转化酶以及氨基酸合成酶等酶的合成。通过补料来控制菌体生长速率以使酶的合成明显去阻退；通过补料还可以减小分解代谢产生的乙醇、甲酸、乳酸等副产物对菌体生长的不利影响。

（4）维持有利的发酵条件

发酵过程中常常发生pH值的变化，直接加酸或加碱可以快速调整酸碱度，而通过补加碳源或氮源，可以缓慢而根本地调整pH值；对于好氧发酵，一次性投糖过多会造成细胞生长过快，快速消耗氧气，而常规的通风搅拌无法满足供氧需求。补料可以缓解该矛盾；此外，补料还可调整发酵液粘度、氧传递系数等物性参数，改善发酵环境，有利于细胞生长和产物合成。

5.补料发酵的控制

补料发酵有两个基本问题。一个是补什么。补加的物质应该是能产生最大效应的营养物。这需要对发酵微生物生理和生化有充分的了解。另一个是如何控制补料。补料过量或不足都会影响菌体生长和产物的形成，甚至会导致发酵失败。

5.1无反馈控制的补料

这种控制方式所加入营养物的流量是预先设定的。因此，反映系统状态的数学模型的准确程度是成败的关键。目前无反馈控制补料方式有三种：恒速补料、变速补料和指数补料。

（1）恒速补料

在恒速补料发酵中，以预先设定的恒定速率补加限制性营养物。相对菌体来说，营养物浓度是逐渐降低的，菌体比生长速率也是下降的，而菌体总量是线性增加的。恒速补料在一定程度上满足了菌体对养料的需要，避免了营养物抑制，但这种方法往往只是根据一个参数指标控制的。这类操作常见于早期报道。

（2）变速补料

变速补料是在培养过程中补加速率以梯度、阶段或线性等方式不断增加。它可以在菌体浓度较高的情况下加入更多营养物来促进细胞的生长，实现细胞比生长速率不断增加，有利于产物的形成。尽管比较粗糙，但要优于恒速补加法。

（3）指数补料

指数补料是一种简单而行之有效的方法。补加速率呈指数增加，它能够使反应器中营养物浓度控制在较低的水平，而使菌体的比生长速率为恒定值，菌体密度呈指数增加。指数补料较好地配合菌体的生长过程，又不需要特别复杂的仪器，因而，受到了较多的重视。

5.2反馈控制补料

实际发酵过程常会与预设过程有偏差，如果能及时地纠正偏差，就可使反应朝预定方向进行，否则将很难达到预期的目标。

反馈控制补料就是在发酵过程中对反应器内的营养物浓度、产物浓度以及细胞浓度等参数进行实时或在线检测和控制。中间补料的前提就是了解发酵参数与微生物代谢、营养物利用以及产物形成之间的关系，选择恰当的反馈控制参数。

可控制的参数有直接测量参数和间接测量参数。直接测量参数为温度、pH、溶解氧浓度、光密度、营养物浓度、压力和尾气成分等，它们均可用仪器设备直接测量。间接测量参数包括比生长速率、菌体细胞浓度、摄氧率、氧气转移率、二氧化碳增长率和呼吸商等。它们可用一个或多个直接测量参数值评估或计算得到。

（1）简单反馈控制(又称单一循环法)补料

此法控制与营养物利用相偶联的pH或溶解氧浓度等参数，使之保持恒定。例如，预先设定pH恒定值，发酵中菌体代谢产生酸性物质或铵，使pH值发生改变，从而启动控制开关，开始补料，pH恢复至恒定值；以溶解氧浓度作为补料开关则是根据华体会体育最新地址 中某种关键营养物（主要是碳源）消耗，会导致溶解氧浓度迅速改变。

（2）根据营养物摄取或需求量来控制补料

就是在线检测华体会体育最新地址 中营养物浓度，通过补料将营养物控制在设定值内。这类方法在补料控制中常见，控制的对象往往是葡萄糖浓度。如有研究人员采用间歇补料分批发酵纳他霉素。发酵中间歇补糖使葡萄糖浓度维持在2%，纳他霉素的产量可提高35%。

（3）根据比生长速率来控制补料

菌体的比生长速率μ越大，说明该微生物生长得越快，消耗营养物越多。有人利用摄氧率数据来计算比生长速率μ，根据μ控制葡萄糖补加速率，得到高产量的青霉素。

（4）根据尾气成分分析来控制补料

营养物的利用通常伴随着CO₂等气体的释放。测定出口气体，类似于分析营养物，也能用来控制补料速率。在啤酒酵母生产谷胱甘肽中，运用前馈后馈控制系统来调整补料速率F。分析发酵罐排出的尾气用于计算F近似值（前馈），然后用乙酸浓度的实际值来修正F值（后馈）。预先设定CO₂的控制值，实时测定尾气中CO₂，根据其大小调整补料速率。这种控制方法比较简单，可用于产气发酵的控制，但易滞后。

（5）根据细胞形态学控制补料

在一些微生物培养时，细胞形态学变化与培养条件（如溶解氧浓度，剪切速度，华体会体育最新地址 成分密切相关），Ronen研究酵母样真菌发酵普鲁兰多糖。他们确定的补料规则是保持高浓度酵母样细胞。当酵母样细胞浓度减小到某种程度时启动补料。当然，这需要有影像传感器检测发酵液中细胞形态变化。

（6）模糊控制的补料

发酵中的可测参数与生物的生长和代谢之间，难以用确切的数学关系来描述，而用隶属函数来描述它们的模糊关系似乎更加恰当。当常规检测和控制方法难以精确地反映系统的运行状态时，模糊控制理论更有其独到之处。

（7）神经网络控制补料

外界信息通过人的感觉器官经神经传导到大脑，在大脑中，一些神经元细胞被激活，并在各细胞间产生强烈的相互作用，最后形成结论，指挥器官做出反应。人工神经网络控制就是模拟人类大脑的运行机制，采用处理单元代替神经元，依靠贮存于处理单元之间相互关联的信息实现控制。当前，很多人在研究用神经网络模型来描述发酵过程，即所谓发酵过程神经网络控制。采用这一模型来预报发酵状态是否正常，预测发酵阶段，预测代谢状态、产物、营养物浓度和各种抑制状态的产生等。

总结

补料工艺是控制中间代谢、提高产量的一个灵活而有效的手段。当然，应该根据具体菌种或培养条件，确定最适的补料种类、补料量和补料方式。补料控制是整个补料发酵生产中的关键。相对而言，反馈控制的补料方法具有控制准确和操作重复性好等优点。但必需有精确可靠的生化检测仪器，在线测定发酵液温度、酸碱度、营养物和产物等数据。现在的问题是这些检测仪器的研制相对滞后，使用的寿命短和对环境要求高，这些都限制了反馈控制补料工艺的应用。

我们有理由相信，随着人们对微生物生理和生化了解的深入、传感技术的改善以及计算机和现代控制理论不断发展，补料发酵技术必将会有更大的改进和更广泛的工业应用。

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